结核分枝杆菌泛酸激酶的克隆表达及酶学性质.doc

结核分枝杆菌泛酸激酶的克隆表达及酶学性质 作者：张鹭，王庆忠，徐颖，陈嘉臻，路福平，王洪海 【关键词】 结核分支杆菌；,泛酸激酶；基因表达；酶类/分析 Expression, purification and enzyme activity determination of pantothenate kinase from Mycobacterium tuberculosis 【Abstract】 AIM: To obtain CoaA (pantothenate kinase) gene of Mycobacterium tuberculosis, express efficiently in E.coli, purify the target protein and detect its enzyme activity. METHODS: CoaA gene was amplified by PCR with sepecific primers from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, CoaA gene segments were inserted into pET28a and expressed in E.coli BL21 under the induction of IPTG (20, 10 h, 0.5 mmol/L). The recombinant (His)6 fusion protein were purified by NiNTA perification system. The purity of the recombinant CoaA was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). CoaA MW was assayed by Mass spectrometry (MS). The enzyme activity was tested by spectrophotometry. RESULTS: HPLC showed CoaA was highly purified, its Mr were 39 168. CD spectrum showed Mycobacterium tuberculosis CoaA contained 39.3% helix, 13.7% sheet, 14.3% turn, and 32.5% random coil. The kinetic parameters kcat and Km of Mycobacterium tuberculosis CoaA were found to be 273.81 kat/L, 35.27 mol/L for Pantothenate, and to be 169.10 kat/L, 94.43 mol/L for ATP respectively. CONCLUSION: The cloning, and expression of active Mycobacterium tuberculosis CoaA in E. coli systems is successful. These results provide the means for further studies on Mycobacterium tuberculosis CoaA as a potential antituberculosis drug. 【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; pantothenate kinase; gene expression; enzymes/AN 【摘要】 目的：获得具有生物学活性的结核分枝杆菌（Mtb）重组泛酸激酶蛋白. 方法：以结核分枝杆菌模式菌株H37Rv基因组为模板，扩增泛酸激酶基因CoaA(Rv1092c)，克隆入原核表达载体pET28a中，重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达. 在优化后的诱导条件（20，10 h，0.5 mmol/L IPTG）下，收集细菌进行超声破碎，低温高速离心，得到的上清液经镍离子螯合型亲和层析柱纯化重组蛋白. 高效液相色谱及质谱鉴定重组蛋白. 采用酶联法测定重组蛋白的酶学性质. 结果：得到了高表达、高纯度的重组结核分枝杆菌的泛酸激酶，酶催化过程中对泛酸的kcat和Km值分别为273.81 kat/L, 35.27 mol/L；对ATP的kcat和Km值分别为169.10 kat/L, 94.43 mol/L. 重组蛋白经高效液相色谱及质谱鉴定，测得Mr约为39 168. 在5 mmol/L TrisHCl缓冲液，pH值7.5，25条件下，重组CoaA的二级结构中有39.3% 螺旋，13.7% 折叠，14.3% 转角，32.5%无规则卷曲. 结论：成功克隆表达结核分枝杆菌泛酸激酶，酶学性质和二级结构鉴定表明重组泛酸激酶折叠正确，且具有生物学活性，为基于该酶筛选新型抗结核药物奠定了基础. 【关键词】 结核分支杆菌； 泛酸激酶；基因表达；酶类/分析 结核病是全球范围内病死率最高的传染病，寻找新的作用靶点，尤其是结核特有的、生理功能重要的蛋白质(主要是酶类)是开发新药物的重要途径1-2. 泛酸激酶（pantothenate kinase， CoaA），真核生物中为PanK，是结核分枝杆菌进行辅酶A（coA）合成的关键性限速酶3-4，在能量代谢和细胞壁的生物合成过程中至关重要5-7. 截止目前，国内外有关结核分枝杆菌CoaA基因体外表达及相关功能的研究报道较少. 我们克隆表达并纯化泛酸激酶蛋白，并探讨其生物学特性，为以该酶为作用靶点筛选新型抗结核药物的探索提供基础资料. 1材料和方法 1.1材料MtbH37Rv株为上海市肺科医院惠赠；E.coli，DH5，BL21(DE3)，质粒pET28a均为复旦大学遗传工程国家重点实验室保存的菌株，培养于Luria Bertani（LB）培养基. 限制性内切酶，T4DNA连接酶及高保真Pfu Taq DNA聚合酶购自英国NEB公司；NiSO4，BSA，DNA胶回收，质粒抽提及细菌基因组抽提试剂盒均购自上海华舜公司；镍离子螯合型介质为美国Qiagen公司产品；质谱仪为美国Applied Biosystems公司的VoyagerDEPRO；圆二色仪为日本Jasco公司的J175；温控紫外红外分析仪为日本JASCO公司的U550 UV/VIS. 1.2方法 1.2.1结核分枝杆菌CoaA基因的扩增和克隆 1.2.1.1结核分枝杆菌H37Rv全基因组的提取按基因组抽提试剂盒推荐的方法进行. 1.2.1.2结核分枝杆菌CoaA基因PCR引物的设计及扩增根据结核分枝杆菌H37Rv全基因组中CoaA/Rv1092c序列（GI: 15607142），设计特异性的引物：上游引物5CGGGATCCATGTCGCGGCT TAGCGAG3，下游引物5CGGAATTCTTACAGCTTGCGCAGCCGCAG3.上下游引物中分别设计BamH和EcoR限制酶酶切位点(黑体下划线示出). 以H37Rv全基因组为模板，进行PCR扩增. PCR反应条件为：95变性5 min，95变性0.5 min，59退火0.5 min，72延伸1 min，29个循环. 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收试剂盒回收特异性片段. 1.2.1.3结核分枝杆菌CoaA基因的克隆上步所获得的特异性PCR片段，经BamH I和EcoR双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下克隆入同等酶切的pET28质粒. 转化E.coli DH5中，酶切鉴定筛选阳性克隆，命名为pET28CoaA. 阳性重组质粒委托上海生工公司测序. 1.2.2CoaA基因的体外表达将测序正确的pET28CoaA转入BL21，37培养于含50 g/mL卡那霉素LB固体培养基. 挑取单菌落转接至3 mL含50 g/mL卡那霉素LB液体培养基，37中220 r/min培养过夜，次日以体积分数5接种量转接至新鲜液体培养基中，相同条件培养23 h至A600 nm为0.6，加入异丙基D硫代半乳糖苷(IPTG)，37诱导表达4 h左右. 收集菌体，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳检测表达结果. 通过不同浓度IPTG（0，0.01，0.05，0.10，0.25，0.50，0.75， 1.00， 2.00 mmol/L）、 不同温度(37， 30， 20)和不同的诱导时间(4， 7， 10 h)， 摸索最佳的表达条件. 1.2.3重组蛋白的纯化及鉴定pET28CoaA重组表达产物直接用亲和柱一步纯化. 将培养诱导表达后的菌体经pH值7.5的磷酸盐缓冲液洗涤3次后悬浮，于冰上经2 s超声，3 s停，60次，10个循环，每个循环之间间歇2 min超声波破菌，冰浴静置0.5 h，12 000 g离心40 min 2次，取上清液上柱. 用含20，30，50 mmolL咪唑的不连续洗涤缓冲液洗去杂蛋白，再以含250 mmolL咪唑的洗涤缓冲液收集目的蛋白. 1.2.4重组蛋白的性质分析 1.2.4.1质谱及二级结构分析纯化后的产物经透析除盐后，用Bradford法测定蛋白含量，以质谱仪和圆二色仪分别测定纯化重组蛋白质的相对分子量和二级结构. 1.2.4.2重组蛋白的酶学性质测定重组CoaA的酶学性质测定按文献8的方法进行. 反应速度以340 nm处特异性NADH减少量为标志，经JASCO U550 UV/VIS温控紫外红外分析仪测定，以表征重组蛋白的酶学活性. 反应体系组成为80 U/mL的丙酮酸激酶，80 U/mL乳酸脱氢酶，2 mmol/L MgCl2，200 mol/L NADH，200 mol/L 磷酸丙酮酸，反应缓冲体系为50 mmol/L HEPES (pH 8.0). 2结果 2.1CoaA基因的PCR扩增产物和克隆CoaA/Rv1092c基因，全长939 bp，GC含量62.83%. 其PCR产物及 重组质粒经BamH I和EcoR I双酶切后，琼脂糖电泳鉴定，在950 bp附近有特异性条带(图1)，与预计结果一致. 测序结果与H37Rv基因组序列完全吻合. 2.2重组CoaA的表达将重组质粒转入Ecoli B121(DE3)细胞中进行表达，重组表达质粒pET28CoaA经IPTG诱导高效表达，在不同IPTG浓度的诱导下，重组菌株全菌和超声上清表达产物SDSPAGE检测情况，在Mr约为39 000处出现重组CoaA条带(图2). 2.3重组蛋白的纯化和鉴定重组菌株（pET28CoaA）在最佳表达条件下（20，10 h，0.5 mmol/L IPTG），检测蛋白表达为可溶性蛋白. 菌体超声破碎，经NiNTA HisBind Resin亲和层析拄纯化后，SDSPAGE鉴定获得纯度较高的重组蛋白(图3). 2.4重组蛋白高压液相色谱(HPLC)及质谱（MS）鉴定HPLC显示所得重组蛋白纯度很高；MS测得Mr为39 168，与理论计算的Mr 39 199比较，相差-0.87，小于质谱仪测试 1 误差范围. 2.5重组CoaA蛋白二级结构分析用圆二色仪对重组CoaA的结构作了初步测定. 结果显示，在5 mmolL TrisC1，pH 7.5，25条件下，蛋白浓度为0.20 gmL，重组CoaA的二级结构中有的39.3% 螺旋，13.7%的折叠，14.3% 转角，32.5%无规则卷曲. 2.6CoaA酶活测定通过3次重复，测得重组CoaA，在ATP过量情况下，Pantothenate的kcat和Km值分别为273.81 kat/L, 35.27 mol/L；在Pantothenate过量情况下，ATP的kcat和Km值分别为169.10 kat/L, 94.43 mol/L. 在相同条件下，分别用Sn2+，Cu2+， Co2+和 Ca2+等二价阳离子，Na+，K+等一价阳离子，Ni3+等三价阳离子替代Mg2+，测定重组pET28CoaA对离子的需要性（图4）. 显示在Mg2+条件下，CoaA的活性最高，而在一价阳离子情况下，CoaA基本没有活性. 3讨论 CoaA基因编码的CoaA是业已被证实为结合分枝杆菌生长所必须的基因3-7，它是体内coA生物合成起始的关键酶. 本研究所做的系统进化树揭示，结核分枝杆菌的CoaA基因同原核、真核生物（尤其是人类）的同类基因的差异较大，可以做为抗结核药物潜在的靶点9. 为了增加表达蛋白的可溶性，我们采用不同温度和不同浓度的IPTG进行诱导表达，结果发现，选择IPTG浓度为0.5 mmolL在20低温情况下，进行10 h的较长时间的诱导表达，可得到表达量较高的可溶性蛋白. pET系统是E.coli中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，目的基因表达后，可溶性上清成分直接用NiNTA亲和柱一步纯化表达产物，能够快速有效地获得目的蛋白. 在近期的结核蛋白体外重组表达时，柏银兰等10构建了pProEX HTb的高效表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64重组质粒;师长宏等11采用pProEXHT 表达载体大量表达、纯化融合的MPT64与ESAT6蛋白质;李立青等12也在pGEX4T2 高效表达载体中高浓度表达和纯化Rv2450c 基因. 而本研究采取pET28系统表达CoaA蛋白也能达到同样的功效. 在测定重组蛋白的活性时，我们采用相关文献报道的方法，即在反应体系利用PK和LDH酶联反应，通过两步联合反应，在340 nm测定NADH量的变化8，以次测定重组蛋白的酶活性. 检测结果表明，本研究表达纯化的蛋白具有CoaA活性，说明在目的基因的N端融合的6个His并没有改变目的蛋白的生物学活性. 【参考文献】 1 Dye C, Scheele S, Dolin，et al. Consensus statement. Global burden of tuberculosis: Estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring ProjectJ. JAMA, 1999, 282: 677-686. 2 Smith KC, Armitige L, Wanger A. A review of tuberculosis: Reflections on the past, present and future of a global epidemic diseaseJ. Expert Rev Anti Infect Ther, 2003,1:483-491. 3 Rock CO, Park HW, Jackowski S. Role of feedback regulation of pantothenate kinase (CoaA) in control of coenzyme A levels in Escherichia coliJ. J Bacteriol, 2003,185(11): 3410-3415. 4 Leonardi R, Chohnan S, Zhang YM, et al. A pantothenate kinase from Staphylococcus aureus refractory to feedback regulation by coenzyme AJ. J Biol Chem, 2005, 280(5): 3314-3322. 5 Spry C, Chai C, Kirk K, et al. A class of pantothenic acid analogs inhibits Plasmodium falciparum pantothenate kinase and represses the proliferation of malaria parasitesJ. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(11): 4649-4657. 6 Leonardi R, Zhang YM, Virga KG, et al. A unique pantothenate kinase from Staphylococcus aureus and antimicrobial a