耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备.doc

耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、 表达及多克隆抗体的制备 作者：张文利, 申慧, 辛毅, 马郁芳【摘要】 目的: 制备抗耻垢分枝杆菌（Smeg）GlmU 的多克隆抗体, 并对其特异性进行鉴定。方法: 用PCR技术扩增Smeg glmU, 构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29bSmeg glmU, 用IPTG诱导表达, 经NiNTAAgarose柱层析纯化后, 以其为免疫原制备抗Smeg GlmU 的多克隆抗体, 并以间接ELISA方法测定抗体效价, 以Western blot方法鉴定抗体的特异性。结果: 在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU; 以其免疫小鼠获得抗血清, Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体, ELISA测定表明其效价高于16 400。结论: 获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体, 为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础。 【关键词】 GlmU 多克隆抗体 分枝杆菌耻垢分枝杆菌 GlmU为glmU (Smeg glmU) 所编码的产物, 是一种双功能酶, 在 GlcNAc 的活性前体 UDPGlcNAc 的合成过程中催化两步连续的反应: （1）1磷酸葡萄糖胺被 GlmU的乙酰基转移酶活性催化生成1磷酸N乙酰葡萄糖胺。（2）1磷酸N乙酰葡萄糖胺在 GlmU的尿嘧啶转移酶活性催化下生成终产物UDPN乙酰葡萄糖胺1, 2。由于 GlcNAc 是分枝杆菌细胞壁中的重要成分肽聚糖和GlcNAc鼠李糖二糖连接物的必需组成成分, 故推测 GlmU 将对分枝杆菌的生长具有不容忽视的作用。本室已经开展了对GlmU 的研究, 成功构建了glmU基因被敲除的耻垢分枝杆菌模型, 并通过此模型证实了glmU基因是分枝杆菌生长所必需的基因, 为GlmU可作为药物的靶点提供了客观依据 (数据尚未发表)。为了进一步明确GlmU在分枝杆菌内的功能, 本室又构建了对Smeg glmU的反义RNA, 以期通过定向地调控Smeg glmU基因的表达来探讨glmU基因的功能。在应用反义RNA技术进行研究时, 要监测到 GlmU 在蛋白质水平的变化, 这就需要有抗GlmU的抗体, 而目前市场上并没有这样的抗体出售, 为进一步研究GlmU的功能, 我们克隆和表达了Smeg glmU基因, 并应用纯化的表达产物制被抗 Smeg GlmU 的多克隆抗体。1 材料和方法1.1 材料 pMD18T 克隆载体购自宝生物工程 (大连) 有限公司; E.coli NovaBlue 菌株、 E.coli BL21(DE3)菌株和pET29b表达载体购自美国Novagen公司; 耻垢分枝杆菌mc2155菌株购自ATCC公司。1.2 方法1.2.1 目的基因glmU获取及其克隆的构建 在 TIGR 网站 (/tdb/)数据库中, 获取mc2155菌株glmU基因的核苷酸序列(1449 bp)。根据获得的基因序列设计PCR引物, 分别为: 上游引物glmUF: 5CATATGACCGCATCAACCGAGGCCGCG3, 其中具有下划线的序列为 Nde I酶位点; 下游引物glmUR: 5CTCGAGGCTCTCGTCGCCCAACGCCTTG3, 下划线的序列为Xho I 酶位点。以 mc2155 基因组DNA为模版, glmUF和glmUR为引物, 用LA Taq DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的基因Smeg glmU, 回收、 纯化PCR产物, 并将其克隆进pMD18T载体产生克隆质粒pMD18Smeg glmU, 并将其转化入E.coli NovaBlue 细胞中进行扩增。提取质粒 pMD18Smeg glmU, 应用Nde I/Xho I双酶质粒 DNA 鉴定重组质粒, 选取其中被鉴定正确的pMD18Smeg glmU送至日本宝生物工程（大连）有限公司, 用RVM 和M1347测序引物对重组质粒中的Smeg glmU基因进行序列测定。将 DNA 测序结果与 mc2155 glmU基因序列进行比对, 确定所克隆的glmU基因序列的正确性。1.2.2 表达载体pET29bSmeg glmU的构建 应用Nde I/Xho I将pMD18Smeg glmU上的Smeg glmU切割下来, 并亚克隆进经过同样Nde I/Xho I双酶作用的载体pET29b上, 产生 pET29bSmeg glmU。提取重组质粒DNA, 并分别用Nde I/Xho I双酶切及Sma I单酶切两个反应来鉴定pET29bSmeg glmU重组质粒。1.2.3 GlmU蛋白质在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 将 pET29bSmeg glmU重组质粒转化入 BL21(DE3) 宿主细胞中进行诱导表达。在 LB琼脂培养基/Kan上挑取菌落并接种到 3 mL LB/Kan 液体培养基中, 在37振荡培养16 h。次日将培养菌接种到50 mL LB/Kan液体培养基中, 在37振荡培养3 h, 使其A600为0.4-0.6, 加入 IPTG, 使其终浓度达到1 mmol/L, 继续在37振荡培养 3 h, 以诱导GlmU重组蛋白表达。1.2.4 GlmU纯化与鉴定 收获经诱导表达的 BL21(DE3) 细胞, 用5 mL含1 mmol/L PMSF 的 prep lysis buffer（20 mmol/L TrisHCl, 0.5 mol/L NaCl, 20% Glycerol, pH8.0）重悬细菌并置于冰上, 超声破碎细胞 (工作60 s, 间歇90 s, 3个循环), 在4 20 000 g离心30 min, 分别取上清和沉淀。参照QIAGEN公司操作说明, 用 NiNTA亲和层析柱纯化上清中的蛋白质, 收集洗脱液组分。将上清和沉淀组分的样品, 以及洗脱液组分进行凝胶浓度为150 g/L的SDSPAGE 分析后, 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上, 用抗多聚组氨酸的单克隆抗体对膜进行孵育, 之后用偶联有碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG抗体孵育, 并用 5溴4氯3吲哚磷酸 (BCIP)/氮蓝四唑 (NBT) 显色液显色。1.2.5 抗GlmU多克隆抗体的制备 将经亲和层析纯化获得的 GlmU 蛋白质溶液用超滤法进行浓缩、 脱盐处理并稀释后, 与等体积的弗氏不完全佐剂混合, 进行免疫注射雌性非孕 BALB/c 小鼠。经背部皮下多点 (6-10个点) 注射乳化抗原, 共免疫3次, 每隔 2 周加强免疫注射1次, 于末次免疫后 2 周经腹腔内注射抗原（不进行乳化）1次, 1周后采用摘眼球法采集血液, 分离血清并保存在-20。1.2.6 抗血清的特异性鉴定及效价的确定 50 mL的mc2155菌液生长至饱和期, 离心收获细菌, 用超声方法破碎细菌 （工作60 s, 间歇90 s, 8个循环）后, 在 4离心（20 000 g）20 min, 收集上清, 用考马斯亮蓝测定上清中总蛋白浓度, 将上清液稀释2倍、 4倍、 8倍后, 进行150 g/L的SDSPAGE分析, 电泳完毕后将其从凝胶转移到硝酸纤维素膜上, 用获得的血清作为抗体对膜进行孵育, 之后用偶联有碱性磷酸酶的马抗鼠IgG孵育, 并用NBT/BCIP显色。以纯化的重组Smeg GlmU作为阳性对照。将碳酸盐缓冲液 (0.05 mol/L 碳酸盐, pH9.6) 稀释纯化的GlmU蛋白质溶液至5 mg/L包被酶标板; 洗涤后加入30 g/L牛血清白蛋白 (BSA) 溶液进行封闭; 以稀释液 (100 mL PBS+1 g/L BSA) 将待检抗血清从1100开始做倍比稀释, 连续10个梯度, 将各梯度的稀释抗血清依次加入包被有抗原的酶标板中, 以未进行免疫的雌性BALB/c小鼠血清作为阴性对照, 以 PBS 溶液作为空白对照; 洗涤后加入12 000稀释的偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG抗体; 加入底物1 g/L的PNPP(对硝基磷酸盐）, 3 mol/L NaOH 终止反应。用酶标仪测定A405值, 以待测标本A405/阴性对照A405>2.0为阳性, 以出现阳性反应的最高稀释度作为该标本的抗体滴度。2 结果2.1 M. smegmatis glmU基因的扩增及其表达载体的构建 在TIGR数据库中获得耻垢分枝杆菌M. smegmatis mc2155的glmU基因序列, 以PCR方法扩增1 455 bp 大小的M. smegmatis glmU产物 (图1)。将纯化的 glmU基因与pMD18T载体相连形成克隆载体pMD18glmU重组质粒, DNA测序结果显示所克隆的glmU序列与M. smegmatis mc2155菌株数据库中的glmU基因序列完全一致。将pMD18glmU质粒上的glmU连接到pET29b 载体的Nde I和Xho I位点, 构建出表达质粒pET29bglmU。glmU基因产物的 C 端与pET29b载体上的组氨酸标签形成融合蛋白, 便于重组蛋白的快速检测与纯化。图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）2.2 GlmU在大肠杆菌中的表达与鉴定 pET29bglmU表达载体导入到表达宿主细胞 BL21(DE3)中, 用1 mmol/L IPTG诱导GlmU蛋白的表达, 并用组氨酸Ni2+亲和层析柱从上清中纯化GlmU蛋白。SDSPAGE 电泳结果显示(图2), 相对于没有经过 IPTG 诱导表达的菌株, IPTG 诱导表达的菌株在相对分子质量 (Mr) 47 800和61 000之间有较强的蛋白条带产生; 而组氨酸Ni2+亲和纯化的组分电泳分析显示此较强的蛋白条带即为经IPTG诱导表达的蛋白。Western blot结果 (图3) 则进一步证实SDSPAGE 电泳的分析结果, 并更清楚地显示表达的蛋白Mr约为55 000, 与预期的GlmU融合蛋白的Mr 51 120 基本一致。因此, pET29bglmU表达载体在 BL21(DE3)细菌中能被1 mmol/L IPTG诱导表达出可溶性GlmU蛋白。图2 SDSPAGE对pET29bSmeg glmU在大肠杆菌BL21(DE3)中表达分析（略）1: 蛋白质 marker; 2: 诱导的细胞裂解液; 3: 没有诱导的细胞裂解液; 4: 诱导的细胞裂解液上清; 5: 诱导的细胞裂解液沉淀; 6-8: Ni2+NTA 亲和层析的洗脱液组分 1-3.图3 GlmU蛋白的Western blot（抗组氨酸单克隆抗体）分析（略）1: 没有诱导的细胞裂解液; 2: 诱导的细胞裂解液上清; 3: 诱导的细胞裂解液沉淀; 4: 蛋白质marker; 5, 6: Ni2+NTA亲和层析的洗脱液组分1和3.2.3 GlmU多克隆抗体效价的确定及特异性鉴定 用Western blot法对经倍比稀释的M.smegmatis mc2155上清中GlmU进行检测, 以GlmU重组蛋白为阳性对照。以抗GlmU血清作为一抗, 结果显示, 在阳性对照中出现1条特异性条带, 这说明了此抗血清能特异地作用于GlmU重组蛋白; 此外, 在检测M.smegmatis mc2155上清中, 也有1条特异性条带被检测出 (图 4), 位置与纯化的GlmU重组蛋白一致, 说明此抗体能用于检测M.smegmatis中的GlmU蛋白。经间接ELISA法测定, 其中2只小鼠抗血清的抗体滴度分别为151 200和16 400, 表明获得了高效价的抗 GlmU多克隆抗体。图5 Western blot检测 GlmU 多克隆抗体的特异性（略）1: 纯化的GlmU重组蛋白; 2: M.smegmatis mc2155上清液; 3-5: 稀释 (2, 4, 8倍)的M.smegmatis mc2155.3 讨论 耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属, 在进化上亲缘关系很近, 蛋白序列的同源性很高, 以GlmU的为例, 序列相似性比对结果显示在这两种菌株间相同的序列多达74%; 此外, 在耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌之间另一个重要的性质是二者具有相似的细胞壁结构, 而现有的抑制或杀死结核分枝杆菌的药物多是以细胞壁为作用靶点的3, 4。因此在研究过程中应用无致病性、 无传染性、 生长较快的耻垢分枝杆菌替代具有传染性、 致病性、 生长缓慢的结核分枝杆菌, 为揭示结核分枝杆菌中的同源基因的结构和功能, 以及寻找新的靶点抑制剂提供了重要参考。 分枝杆菌的细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构保障, 并且结构独特, 是目前多数抗结核药物的作用靶点。GlmU具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性, 参与细胞壁前体物UDPGlcNAc的生物合成过程, 因此, GlmU功能的正常与否直接影响了细胞壁的完整性及细菌的生存能力。 本研究室已构建了glmU基因敲除菌株并证实了glmU为分枝杆菌生长必需基因 数据尚未发表。对于分枝杆菌生长必需基因, 由于所用的基因敲除方法的限制5, 6, 不能获得一定量的分枝杆菌以进行生长必需基因的功能研究。因此, 我们将采用反义RNA技术下调glmU基因的表达, 研究 GlmU功能及其对细胞壁形成的影响。所以, 我们需要用Western blot 检测反义RNA下调glmU基因表达后, 耻垢分枝杆菌中GlmU蛋白的表达量。本研究通过分子生物学方法克隆了glmU基因并表达了GlmU蛋白, 接着用表达纯化的GlmU 蛋白免疫小鼠从而获得了高效、 特异的抗耻垢分枝杆菌 GlmU 的多克隆抗体, 为我们应用反义RNA技术提供了基础。【参考文献】 1 MenginLecreulx D, Vanheijenoort J. Copurification of glucosamine1phosphate acetyltransferase and Nacetylglucosamine1phosphate uridyltransferase activities of E.colicharacterization of the glmU geneproduct as a bifunctional enzyme catalyzing 2 subsequent steps in the pathway for UDPNacetylglucosamine synthesisJ. J Bacteriol, 1994, 176(18): 5788-5795.2 Olsen LR, Roderick SL. Structure of the E.coli GlmU pyrophosphorylase