肝细胞生长因子及其受体在口腔鳞癌和颈淋巴结中的表达.doc

肝细胞生长因子及其受体在口腔鳞癌和颈淋巴结中的表达【摘要】 目的 通过检测肝细胞生长因子(HGF)及其受体cMet在口腔鳞癌中的表达水平，探讨HGFcMet系统对口腔鳞癌侵袭转移的影响。 方法 对50例确诊的原发、复发口腔鳞癌病例标本，采用免疫组织化学(SABC)法检测口腔鳞癌组织和颈部淋巴结中HGF和cMet的表达情况。将收集的病例按病理类型及临床资料分组，并比较各组间HGF和cMet的表达差异。 结果 口腔鳞癌组织及有转移灶的淋巴结中，癌细胞HGF及cMet蛋白的阳性表达率为100，颈部淋巴结中HGF的阳性率为60，淋巴细胞内均无cMet蛋白的表达。癌细胞cMet蛋白的表达水平和颈淋巴结内淋巴细胞HGF表达阳性与口腔鳞癌的局部淋巴结转移高度相关(P=0000?0)，癌细胞中HGF的高水平表达与肿瘤的侵袭（P=0.002?0）、复发相关（P=0.013?9）。 结论 口腔鳞癌中HGF和cMet蛋白表达升高、颈部淋巴结中淋巴细胞HGF表达阳性可能促进肿瘤的侵袭、复发、局部淋巴结转移，提示患者预后不良。 【关键词】 口腔肿瘤；淋巴转移；肝细胞生长因子；原癌基因蛋白质cmetTo explore the effect of the HGFcMet system on invasive and metastasis potential of oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods Fifty biopsy samples were collected from primary and relapse OSCC patients. Immunohistochemical staining was used to determine the expression of hepatocyte growth factor (HGF) and cMet protein in OSCC tissues and neck nodes. Samples were divided into groups based on clinicopathological features and then the expression intensity was analyzed between groups. Results The expression rate of HGF and cMet in carcinoma cells was 100. The HGF expression rate in neck nodes was 60%. However, cMet was not expressed in the lymphocytes of neck nodes. High expression level of HGF in carcinoma cells and positive expression of cMet in the lymphocytes of neck lymph nodes significantly correlated with lymph nodes metastasis (P=0.000?0), and high expression level of HGF had trends to invade (P=0.002?0) and relapse(P=0.013?9). Conclusions Overexpression of HGF and cMet in OSCC and positive expression of cMet in the lymphocytes of neck nodes may induce invasion, recurrence and metastasis, predicting a poor prognosis.Key words： Mouth neoplasms; Lymphatic metastasis； Hepatocyte growth factor；Protooncogene protein cmet 鳞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，据临床统计，大约80的口腔鳞癌患者死于肿瘤的侵袭与转移。故研究肿瘤侵袭、转移的机理对口腔鳞癌的临床防治有重要意义。近年，随着对肿瘤侵袭、转移机理的深入研究，发现一些细胞因子参与了肿瘤的侵袭、转移，这些细胞因子通过与受体结合并经信息传递引发癌细胞的运动。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是近年来在肿瘤研究中倍受关注的细胞因子，与其受体结合后能刺激多种类型的细胞分化、增殖、再生、运动、迁移及形态的发生。研究表明，许多恶性肿瘤的生长、侵袭和转移与HGFcMet系统有关1。探讨HGFcMet系统在口腔鳞癌侵袭转移中的作用，为口腔鳞癌的预后判断、治疗方法的开发提供实验依据。 1 资料与方法11 资料 收集山东大学齐鲁医院口腔颌面外科2005年1月至2006年12月收治的原发、复发口腔鳞癌及颈部淋巴结标本50例，男28例，女22例， 3575岁；原发42例，复发8例，颈部淋巴结转移14例；肿瘤直径小于2?cm 15例，24?cm之间23例、大于4?cm 12例；无肌肉、骨皮质等邻近组织侵犯29例，有邻近组织侵犯21例；按病理类型分类，高、中、低分化依次为28例、9例、13例。收集口腔内正常粘膜标本20例，其中唇粘膜7例，牙龈10例，颊粘膜3例，分别取自唇裂、拔智齿、外伤病例。收集15例非肿瘤患者的颈部淋巴结标本作为对照组，其中颌下腺炎患者8例、甲状舌管囊肿3例、鳃裂囊肿3例、外伤1例。12 方法 所有标本均经4多聚甲醛固定24?h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成蜡块。采用即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司，SA1022)检测口腔鳞癌组织、颈清淋巴结、正常粘膜中HGF和cMet的表达。采用的一抗均为兔抗人多克隆抗体 (武汉博士德公司BA0911、BA0468，工作浓度均为150)。将包埋好的标本蜡块以5?m厚度切片，采用二次展片法使组织切片粘贴于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，60?烤片2?h，组织切片经二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，置于柠檬酸缓冲液（0.01?molL pH60)中以煮沸法修复抗原，依试剂盒说明书操作步骤进行，一抗4?孵育过夜，DAB显色，苏木精轻度复染细胞核。采用已知有HGF和cMet表达的乳腺癌标本做阳性对照，以PBS做阴性对照。1.3 统计学处理 口腔鳞癌组织内HGF和cMet表达统计方法：在400倍的光镜放大倍数下，分别计算5个细胞密集的视野内阳性细胞的百分率，然后取其平均值作为该病例的HGF和cMet的表达强度。采用CS10.34统计软件对数据进行处理，数据以均数标准差（s）表示，组间比较采用配对t检验，P<0.05为有统计学意义，P<0.02为有显著统计学意义； 颈淋巴结HGF和cMet表达统计方法：分别计算颈部淋巴结内有HGF和cMet阳性表达的病例数，以CS10.34统计软件对数据进行处理。 2 结 果 正常粘膜仅有两例上皮细胞表达HGF，阳性率为10（2/20），阳性强度为18.5和23.7；所有正常粘膜均无cMet表达，阳性率为0。HGF和cMet在口腔鳞癌中的表达：免疫组化染色显示HGF的阳性信号位于肿瘤细胞的胞浆，阳性率为100，并且可见在癌巢中心部位阳性信号最强，见图1。cMet的阳性信号位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜，阳性率为100，见图2。统计结果显示肿瘤的侵袭性、复发与癌细胞中HGF的高表达相关，肿瘤的颈淋巴结转移与癌细胞中cMet的高表达相关，肿瘤大小、病理分化类型与HGF和cMet无明显相关性。肿瘤细胞中HGF和cMet表达强度与临床特征的关系，见表1。HGF和cMet在颈部淋巴结中的表达：非肿瘤对照组淋巴结中HGF阳性率为26.7（4/15,3例颌下腺炎和1例甲状舌管囊肿），cMet的阳性率为0。口腔鳞癌组颈淋巴结内HGF阳性率为60（30/50），其中有转移13例，无转移17例，阳信信号位于部分淋巴细胞胞浆内和所有转移灶的癌细胞的胞浆，见图3、图4。有淋巴结转移的病例中有1例淋巴细胞胞浆HGF表达阴性；cMet的阳性信号只位于有转移灶的癌细胞的胞浆和胞膜（14/50），见图5。统计结果显示口腔鳞癌组颈淋巴结内淋巴细胞HGF阳性表达率明显高于非肿瘤对照组，见表2。口腔鳞癌的颈淋巴结转移与颈淋巴结中HGF的表达阳性具有相关性，见表3。表1 肿瘤细胞中HGF和cMet表达强度与临床特征的关系（略）表2 鳞癌组和对照组中HGF表达比较（略）表3 淋巴细胞HGF表达情况与颈淋巴结转移的关系（略） 3 讨 论 本研究结果显示HGF/cMet系统与口腔鳞癌的侵袭、复发和颈部淋巴结转移明显相关，有邻近组织侵袭组和复发病例组HGF表达高于无侵袭组和原发组，颈淋巴结有转移组cMet表达高于无转移组。因此，HGF/cMet的高表达可能促进了口腔鳞癌的局部侵袭、复发和淋巴结转移。 许多学者对HGF/cMet系统在肿瘤发展中的作用做过研究，结果表明，cMet受体与HGF结合后，造成肿瘤细胞的增殖、运动、侵袭并促进肿瘤微血管的形成。Aoki T等的研究发现在涎腺肿瘤中环氧化酶（Cox2）的表达强度与HGF的表达强度密切相关，而Cox2在肿瘤的侵袭和抑制凋亡中起重要作用2。Fassetta M证实HGF可以逆转P38MAPK介导的结直肠癌细胞的死亡，从而增加癌细胞的存活力3。本研究观察到在鳞癌癌巢中心有HGF强阳性表达，故推测HGF在口腔鳞癌中抑制了癌细胞的凋亡，增加了肿瘤复发几率。体外培养的口腔鳞状细胞癌细胞系(H375、H376)导入HGF后能显著提高其MMP2、MMP9的含量4。而MMP是肿瘤侵袭的必要条件，通过分解基质为癌细胞侵袭邻近组织创造条件。在体外培养的乳腺癌细胞和胃癌细胞中观察到HGF通过调整E钙粘蛋白的表达而增强肿瘤细胞的播散、侵袭能力56。在口腔鳞癌的发展过程中可能也有类似机制存在，本研究发现有邻近组织侵袭的病例组肿瘤中HGF的表达升高。另有学者的研究发现，HGF有促血管生成作用7，蔡永国等观察到胃癌组织中cMet阳性组微血管密度高于对照组8。故在口腔鳞癌中HGF/cMet系统可能也有增加肿瘤血供的作用，但仍需进一步的实验证实。 本研究发现，口腔鳞癌组织及颈淋巴结中HGF/cMet的高水平表达促进了肿瘤的侵袭、复发和淋巴结转移，提示预后不良。在其它类型的恶性肿瘤中也有类似现象存在，有学者已证实cMet蛋白可作为头颈部鳞癌有无淋巴结转移的分子标志物9，在胃癌、食道鳞癌、下咽鳞癌、肝癌等组织中都可检测到HGF/cMet的表达，在患者血清中有HGF水平的升高，且均与肿瘤的转移、患者的预后密切相关1013。因此，对于高表达HGF/cMet的病例应适当扩大切除范围、加强综合治疗和术后随访。 鉴于HGF/cMet系统在肿瘤的侵袭、复发和转移过程中的重要作用，我们设想阻断HGF/cMet系统对恶性肿瘤的治疗应有积极作用。已有学者在这方面做了探索，Cassinelli G等在体外培养的肺癌细胞（H460，N592）中应用酪氨酸激酶抑制剂RPI1降低cMet的表达及活力，从而抑制了癌细胞本能的和HGF诱导的转移能力，同时减少了VEGF和TGF的表达14。这对于我们寻求治疗口腔鳞癌的新方法提供了有益启示。【参考文献】 1Aoki T， Tsukinoki K， Kurabayashi H， et al Hepatocyte growth factor expression correlates with cyclooxygenase2 pathway in human salivary gland tumorsJ. 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