肿瘤患者外周血中抑制性受体LAIR1表达升高.doc

肿瘤患者外周血中抑制性受体LAIR-1表达升高 作者：薛江楠, 王春艳, 张晓姝, 曹奇志, 宿振国【摘要】 目的: 研究LAIR-1在肿瘤患者中的表达, 探讨其在抗肿瘤免疫应答中的作用。方法: 应用夹心ELISA检测肿瘤患者血清中可溶型sLAIR-1的水平；应用免疫荧光染色和流式细胞术分析, 观察LAIR-1在患者PBMC中NK细胞、 CD4T细胞、 CD8T细胞和B细胞上的表达。结果: 肿瘤患者血清sLAIR-1水平为（4.63.2） g/ L, 明显高于正常人血清sLAIR-1 水平（3.93.0） g/L, P<0.05。NK细胞, CD4+ T细胞及CD8+ T细胞表达LAIR-1水平上调。肺癌患者CD4/CD8比值明显低于正常人, B细胞百分率明显高于正常人。NK细胞、 CD4+ T细胞CD8+ T细胞中LAIR-1的表达阳性率高于对照组。结论: 在肿瘤患者LAIR-1分子表达水平高于正常人。肿瘤患者抑制性受体LAIR-1 表达水平的上调可能与肿瘤的免疫逃逸有关。 【关键词】 LAIR-1 CD305 抑制性受体 肿瘤近年来免疫抑制性受体的研究进展迅速, 它们在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。白细胞相关免疫球蛋白样受体1(leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1, LAIR-1) 为一种免疫抑制性受体, 表达于包括T细胞和NK等在内的多种免疫细胞上, 并抑制这些细胞的功能1, 2004年在第8届国际人白细胞分化抗原专题讨论会上获CD305编号2。目前国内外还缺乏LAIR-1与肿瘤疾病相关性的研究报道。鉴于T细胞和NK细胞等在人体抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用3, 而LAIR-1能够广泛抑制上述免疫细胞的功能, 我们采用夹心ELISA法和流式细胞术分别对肿瘤患者血清可溶型LAIR-1（sLAIR-1）水平和外周血淋巴细胞上LAIR-1分子的表达进行了检测, 并对LAIR-1与肿瘤免疫的相关性进行了探讨, 为进一步了解肿瘤细胞与免疫系统的相互关系提供新的线索, 并为肿瘤疾病的免疫治疗提供依据。1 材料和方法1.1 材料 FITC标记的单克隆抗体(mAb) FMU-LAIR1.1 和sLAIR-1夹心ELISA检测试剂盒由第四军医大学免疫学教研室制备4。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品, 小牛血清( FCS)购自杭州四季青生物材料公司。PE、 FITC或PE/Cy5标记的小鼠抗人CD3、 CD4、 CD8、 CD19、 CD56和同型对照 mAb 购自晶美公司。肿瘤患者33例, 男20例, 女13例, 经活检病理诊断确诊, 年龄1750（平均45.6）岁。30例正常人为健康体检者, 男13例, 女17例, 年龄1719（平均18）岁。血清由滨州医学院附属医院检验科及第四军医大学西京医院协助收集。1.2 方法1.2.1 血清标本采集 患者血清于治疗及手术前采集, 室温下静置30 min后, 2 000 r/min 离心10 min, 取血清, 置-20冰箱保存。1.2.2 sLAIR-1的检测 夹心法ELISA检测 sLAIR-1检测方法由第四军医大学免疫学教研室建立, 按常规方法检测4。1.2.3 流式细胞术分析 无菌抽取正常人和肿瘤患者外周血,肝素抗凝, Ficoll 密度梯度法分离PBMC, 100 mL/L FCS RPMI1640培养基重悬。用PE、 FITC或PE/Cy5标记的小鼠抗人CD3、 CD4、 CD8、 CD19和CD56 mAb进行膜表面荧光标记, 流式细胞术检测。1.2.4 统计学处理 采用SPSS10.0软件进行数据分析, 数据以xs表示, 计量资料均数比较采用方差分析。2 结果2.1 sLAIR-1在肿瘤患者和健康人血清中的水平 共检测33例肿瘤疾病患者和30例健康人血清中sLAIR-1的水平。肿瘤患者血清sLAIR-1 的水平为(4.63.2) g/ L, 明显高于正常人血清sLAIR-1 水平(3.93.0) g/L, P<0.05）。图1 正常人与肿瘤患者血清LAIR-1水平的比较（略）Fig 1 Comparisons of serum sLAIR-1 levels between healthy individuals and patients with tumor2.2 LAIR-1在肿瘤患者和健康人外周血NK细胞、 CD4T细胞、 CD8T细胞和B细胞上的表达 检测了5例癌症患者和5例健康人外周血NK细胞、 CD4T细胞、 CD8T细胞和B细胞上的表达。其中肺癌患者3例, 胆管癌和胃癌各1例。发现2例肺癌患者中CD4和CD8阳性细胞的百分率分别17.5%和45.8%, CD4/CD8为比值明显低于正常人, 但CD4+T细胞和CD8+T细胞中LAIR-1表达百分率均也有所升高。同时在B细胞和NK细胞中也观察到LAIR-1明显升高的现象。3 讨论 比较了肿瘤患者和正常人血清sLAIR-1的水平及外周血淋巴细胞不同群和亚群膜型LAIR-1表达的变化, 发现肿瘤患者血清sLAIR-1水平明显高于正常人, 其中肝癌患者sLAIR-1水平显著高于正常人。我们前期的研究显示, sLAIR-1的水平与膜型LAIR-1的表达正相关5。因此, 观察了5例癌症患者外周血淋巴细胞上LAIR-1的表达, 在2例肺癌患者中观察到CD4和CD8阳性细胞的百分率和CD4/CD8为比值明显低于正常人, 而B细胞的百分率明显高于正常人。而且NK细胞、 CD4+ T细胞CD8+T细胞中LAIR-1表达百分率均也有所升高。以上结果提示LAIR-1分子表达水平的升高可能与肿瘤的发生和发展有关。 细胞免疫在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。参与抗肿瘤免疫的细胞包括NK细胞、 NKT细胞、 T细胞、 T细胞、 巨噬细胞和树突状细胞（DC）等。同时, 肿瘤也可通过多种机制抑制机体的免疫功能并诱导对肿瘤细胞的免疫耐受, 从而逃避免疫系统对它的清除。这些机制包括抑制性受体对免疫细胞活化的抑制作用；诱导抑制性细胞的产生, 如CD4+CD25+ Foxp3调节性T细胞(Tregs), 分泌抑制性细胞因子, 如TGF-的分泌等6。近年来免疫抑制性受体在肿瘤免疫和肿瘤免疫治疗中作用也日益受到重视。已发现表达于活化的T细胞上的抑制性受体CTLA-4(CD152)和PD-1在肿瘤免疫应答中发挥重要作用。阻断它们与其配体的结合, 能够增强T细胞的活化, 促进对肿瘤的清除7。Sheu等8报道, C-型凝集素家族的免疫抑制性NK细胞受体CD94/NKG2A在宫颈癌肿瘤浸润的CD8T细胞上的表达上调, 并且抑制CD8T细胞的杀伤功能。因此推测CD94/NKG2A表达的提高可能与肿瘤的免疫逃逸有关。 LAIR-1为一种免疫抑制性受体, 最近发现胶原是其高亲和力的配体9。LAIR-1与目前已鉴定的其它抑制性受体相比具有更广泛的表达谱, 组成性表达于NK细胞、 T细胞、 B细胞、 单核/巨噬以及DC细胞等, 并抑制上述免疫细胞的功能。LAIR-1在初始T细胞上高水平的表达, 并且抑制TCR介导的信号转导, 提示LAIR-1可能在免疫应答的早期阶段发挥作用10。本研究中, 我们观察到LAIR-1在肿瘤患者中的表达上调。鉴于肿瘤细胞可利用抑制性受体逃避机体免疫系统的应答11, 对LAIR-1在肿瘤免疫应答中的作用值得更进一步的研究。【参考文献】 1 Meyaard L, Adema GJ, Chang C, et al. LAIR-1, a novel inhibitory receptor expressed on human mononuclear leukocytesJ. Immunity, 1997, 7(2): 283-290.2 金伯泉. 人类白细胞分化抗原CD命名的最新进展J. 细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21(2): 131-132.3 Drew Pardoll. Does the immune system see tumors as foreign or self ? J. Annu Rev Immunol, 2003, 21: 807-839.4 Ouyang WM, Xue JN, Liu JM, et al. Establishment of an ELISA system for determining soluble LAIR-1 levels in sera of patients with HFRS and kidney transplantJ. J Immunol Methods, 2004, 292(1-2): 109-117.5 薛江楠, 欧阳为明, 贾 卫, 等. 夹心ELISA检测可溶型LAIR-1方法的建立及其应用的研究J. 上海免疫学杂志, 2003, 23（4）: 268-271.6 Joseph NB, Philip D. Cancer immunotherapy: A treatment for the massesJ. Science, 2004, 305(5681): 200-205.7 Waldmann TA. Effective cancer therapy through immunomodulationJ. Annu Rev Med, 2006, 57: 65-81.8 Sheu BC, Chiou SH, Lin HH, et al. Up-regulation of inhibitory natural killer receptors CD94/NKG2A with suppressed intracellular perforin expression of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes in human cervical carcinomaJ. Cancer Res, 2005, 65(7): 2921-2929.9 Lebbink RJ, de Ruiter T, Adelmeijer J, et al. Collagens are functional, high affinity ligands for the inhibitory immune receptor LAIR-1J. J Exp Med, 2006, 203(6): 1419-1425.10 Kerima M, Masilamani M, Valas R, et al. The inhibitory leukocyte-associa