视黄醇结合蛋白4在糖尿病动脉粥样硬化大鼠血清中的表达及意义.doc

视黄醇结合蛋白4在糖尿病动脉粥样硬化大鼠血清中的表达及意义【摘要】 目的 观察脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)与晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein product，AOPP)在糖尿病动脉粥样硬化大鼠血清中的表达，探讨RBP4与糖尿病大血管病变的关系。方法 将36只SPF级健康Wistar雄性大鼠随机分为2组(各18只)。A组为正常对照组，饲普通饲料。B组为糖尿病动脉粥样硬化组，饲以高脂高糖饲料并予腹腔一次性大剂量注射链脲佐菌素(STZ)及予维生素D3灌胃，建立糖尿病动脉粥样硬化模型。16 w后所有大鼠空腹过夜，应用10%水合氯醛腹腔麻醉后心脏采血离心分离血清，全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的含量，酶联免疫吸附法(ELISA)测血清RBP4水平，紫外分光光度计法测血清AOPP含量。取腹主动脉做HE染色。结果 B组大鼠血清中TG、TC、LDLC含量均较A组增高，HDLC降低，RBP4显著增高。AOPP、血浆致动脉硬化指数(AIP)与RBP4呈正相关。腹主动脉HE染色显示B组动脉壁内侧内膜下有大量泡沫细胞聚集，纤维组织增生，部分纤维化和玻璃样变，并见明显钙化。A组无此改变。结论 根据上述结果，我们认为RBP4参与糖尿病的大血管病变，其可能机制是增强血管内膜氧化应激并影响血脂代谢。 【关键词】 视黄醇结合蛋白4;晚期氧化蛋白产物;糖尿病大血管病变胰岛素抵抗(IR)不仅是糖尿病的主要病理生理基础，也与糖尿病的大血管并发症密切相关;脂肪细胞分泌的部分脂肪因子，如瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子均能导致IR。Yang等1发现一种新的脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白4(RBP4)，能促进IR的发生，参与糖尿病的发生发展。但RBP4与糖尿病所致动脉粥样硬化的关系鲜见报道。因此，本课题拟观察RBP4在糖尿病动脉粥样硬化大鼠中的表达，探讨RBP4与糖尿病大血管病变的关系及其可能机制。1 材料与方法1.1 实验动物 SPF级健康Wistar雄性大鼠36只，10周龄，体重200220 g，由武汉大学实验动物中心提供。1.2 实验试剂及设备 血清RBP4检测试剂盒由美国USCN生命科学技术公司提供，高速低温离心机由美国Sigma公司提供，紫外分光光度计752由上海精密仪器有限公司提供，维生素D3注射液、胆固醇、胆酸钠、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、冰醋酸均由上海通用药业股份有限公司提供，链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，烟酰胺(NA)由广州龙沙有限公司提供，普通饲料由湖北省实验动物中心提供，氯胺T、氯化钾(KCl)试剂由上海国药集团化学试剂有限公司提供。1.3 动物模型建立及分组 将36只健康雄性Wistar大鼠称体重，随机分为A组正常对照组(n=18)和B组糖尿病动脉粥样硬化组(n=18)。每笼34只，正常昼夜交替，均自由饮食饮水，适应性喂养1 w。实验开始前大鼠均禁食8 h，自由饮水。A组喂普通饲料，一次性腹腔注射生理盐水260 mg/kg，B组以260 mg/kg的剂量腹腔注射NA溶液，15 min后尾静脉注射STZ 60 mg/kg(STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中，pH 4.5),同时给予VD3注射液按总剂量60万IU/kg分3 d灌胃，在上述基础上连续喂饲高糖高脂饲料(高糖高脂饲料为在普通饲料的配方中添加5%糖、1%胆固醇、0.35%胆酸、5%猪油、0.61丙基硫氧嘧啶)2。监测体重、24 h进食量及饮水量。2 w后禁食12 h检测空腹血糖，B组大鼠血糖均7.8 mmol/L。2月后在A、B组各随机抽取1只大鼠处死取腹主动脉证实建模成功。各组饮食同前，继续喂养2月。期间B组死亡2只。1.4 血清学指标测定 16 w后，实验结束时，所有大鼠空腹12 h予10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清。用CTX型全自动生化分析仪测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。按公式logTG/HDL C计算血浆致动脉硬化指数(AIP)3。1.5 血清RBP4及晚期氧化蛋白产物(AOPP)检测 血清RBP4用酶联免疫吸附法测定，使用血清RBP4检测试剂盒。血清AOPP用紫外分光光度计法测定。1.6 病理学检测 所有大鼠空腹12 h后，予10%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，处死大鼠，分离腹主动脉，4%甲醛溶液(pH=7.4)固定，HE染色。1.7 统计学分析 使用SPSS13.0统计软件，结果以xs表示，两组间比较采用t检验，单因素相关分析用Pearson和Spearman相关分析。2 结 果2.1 血清RBP4、AOPP含量变化及血脂检测结果 与A组比较，B组RBP4和AOPP明显升高(P<0.01，P<0.05)，与A组比较，B组TC明显增高(P<0.01)。LDLC在B组中较A组明显增高(P<0.01)。AIP在B组高于A组(P<0.01)。见表1。【摘要】 目的 观察脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)与晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein product，AOPP)在糖尿病动脉粥样硬化大鼠血清中的表达，探讨RBP4与糖尿病大血管病变的关系。方法 将36只SPF级健康Wistar雄性大鼠随机分为2组(各18只)。A组为正常对照组，饲普通饲料。B组为糖尿病动脉粥样硬化组，饲以高脂高糖饲料并予腹腔一次性大剂量注射链脲佐菌素(STZ)及予维生素D3灌胃，建立糖尿病动脉粥样硬化模型。16 w后所有大鼠空腹过夜，应用10%水合氯醛腹腔麻醉后心脏采血离心分离血清，全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的含量，酶联免疫吸附法(ELISA)测血清RBP4水平，紫外分光光度计法测血清AOPP含量。取腹主动脉做HE染色。结果 B组大鼠血清中TG、TC、LDLC含量均较A组增高，HDLC降低，RBP4显著增高。AOPP、血浆致动脉硬化指数(AIP)与RBP4呈正相关。腹主动脉HE染色显示B组动脉壁内侧内膜下有大量泡沫细胞聚集，纤维组织增生，部分纤维化和玻璃样变，并见明显钙化。A组无此改变。结论 根据上述结果，我们认为RBP4参与糖尿病的大血管病变，其可能机制是增强血管内膜氧化应激并影响血脂代谢。 【关键词】 视黄醇结合蛋白4;晚期氧化蛋白产物;糖尿病大血管病变胰岛素抵抗(IR)不仅是糖尿病的主要病理生理基础，也与糖尿病的大血管并发症密切相关;脂肪细胞分泌的部分脂肪因子，如瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子均能导致IR。Yang等1发现一种新的脂肪细胞因子视黄醇结合蛋白4(RBP4)，能促进IR的发生，参与糖尿病的发生发展。但RBP4与糖尿病所致动脉粥样硬化的关系鲜见报道。因此，本课题拟观察RBP4在糖尿病动脉粥样硬化大鼠中的表达，探讨RBP4与糖尿病大血管病变的关系及其可能机制。1 材料与方法1.1 实验动物 SPF级健康Wistar雄性大鼠36只，10周龄，体重200220 g，由武汉大学实验动物中心提供。1.2 实验试剂及设备 血清RBP4检测试剂盒由美国USCN生命科学技术公司提供，高速低温离心机由美国Sigma公司提供，紫外分光光度计752由上海精密仪器有限公司提供，维生素D3注射液、胆固醇、胆酸钠、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、冰醋酸均由上海通用药业股份有限公司提供，链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司，烟酰胺(NA)由广州龙沙有限公司提供，普通饲料由湖北省实验动物中心提供，氯胺T、氯化钾(KCl)试剂由上海国药集团化学试剂有限公司提供。1.3 动物模型建立及分组 将36只健康雄性Wistar大鼠称体重，随机分为A组正常对照组(n=18)和B组糖尿病动脉粥样硬化组(n=18)。每笼34只，正常昼夜交替，均自由饮食饮水，适应性喂养1 w。实验开始前大鼠均禁食8 h，自由饮水。A组喂普通饲料，一次性腹腔注射生理盐水260 mg/kg，B组以260 mg/kg的剂量腹腔注射NA溶液，15 min后尾静脉注射STZ 60 mg/kg(STZ溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中，pH 4.5),同时给予VD3注射液按总剂量60万IU/kg分3 d灌胃，在上述基础上连续喂饲高糖高脂饲料(高糖高脂饲料为在普通饲料的配方中添加5%糖、1%胆固醇、0.35%胆酸、5%猪油、0.61丙基硫氧嘧啶)2。监测体重、24 h进食量及饮水量。2 w后禁食12 h检测空腹血糖，B组大鼠血糖均7.8 mmol/L。2月后在A、B组各随机抽取1只大鼠处死取腹主动脉证实建模成功。各组饮食同前，继续喂养2月。期间B组死亡2只。1.4 血清学指标测定 16 w后，实验结束时，所有大鼠空腹12 h予10%水合氯醛腹腔麻醉，心脏采血，3 000 r/min离心10 min，分离血清。用CTX型全自动生化分析仪测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。按公式logTG/HDL C计算血浆致动脉硬化指数(AIP)3。1.5 血清RBP4及晚期氧化蛋白产物(AOPP)检测 血清RBP4用酶联免疫吸附法测定，使用血清RBP4检测试剂盒。血清AOPP用紫外分光光度计法测定。1.6 病理学检测 所有大鼠空腹12 h后，予10%水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，处死大鼠，分离腹主动脉，4%甲醛溶液(pH=7.4)固定，HE染色。1.7 统计学分析 使用SPSS13.0统计软件，结果以xs表示，两组间比较采用t检验，单因素相关分析用Pearson和Spearman相关分析。2 结 果2.1 血清RBP4、AOPP含量变化及血脂检测结果 与A组比较，B组RBP4和AOPP明显升高(P<0.01，P<0.05)，与A组比较，B组TC明显增高(P<0.01)。LDLC在B组中较A组明显增高(P<0.01)。AIP在B组高于A组(P<0.01)。见表1。2.2 RBP4与AOPP、API的相关分析 AOPP与RBP4正相关(r=0.505，P=0.023);RBP4与AIP正相关(r=0.565，P=0.009)。2.3 主动脉病理学检测 A组示正常动脉壁，内侧内膜光滑，整齐。B组则可见动脉壁内侧内膜纤维组织增生，部分纤维化和玻璃样变，并有大片蓝染钙化灶，其周围出现透明变性的胶原纤维，有明显动脉粥样硬化表现，见图1。表1 血清学指标变化3 讨 论研究发现RBP4主要由肝脏和脂肪组织分泌，且脂肪源性RBP4能通过降低磷脂酞肌醇3激酶(PI3K)活性促使肌肉组织发生胰岛素抵抗4，还可直接诱导肝脏磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因的表达，增加肝糖输出，促进IR的发生。本研究发现，RBP4在糖尿病动脉粥样硬化大鼠中表达明显增高，说明RBP4不仅促进IR，而且参与糖尿病大血管病变的发生发展，同时，发现RBP4可能是通过影响血脂代谢参与动脉粥样硬化的发生发展。AOPP主要成分是血清白蛋白被自由基和反应性氧系(主要是中性粒细胞的髓过氧化酶产生的氯化氧化物) 氧化后的产物5，6，是临床研究中反映蛋白氧化程度的敏感可靠指标7。相关研究提示8，AOPP在动脉粥样硬化患者体内显著增高，AOPP通过氧化应激引起内皮细胞损伤可能是其参与动脉粥样硬化发生、发展的机制之一。本实验结果与Kaneda等研究结果一致9，证明糖尿病大血管病变中存在氧化应激增强，RBP4可能通过增强机体氧化应激参与糖尿病大血管病变的发生发展。这为我们治疗糖尿病大血管病变提供了一条新思路，即可以通过减少RBP4的产生干预氧化应激，从而阻止糖尿病大血管病变的发生发展。【参考文献】 1 Yang Q，Graham TE，Mody N,et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetesJ.Nature，2005;436(7049)：35662.2 路一平,邱 健,詹纯列.实验性糖尿病动脉粥样硬化大鼠模型的建立J.四川动物杂志，2006;25(1):1658.3 胡耀敏，田浩明，刘 瑞.血浆致动脉硬化指数与2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度的相关性研究J.四川大学学报，2004;35(5)：6968.4 Graham TE，Yang Q，Blither M,et al.Retinolbinding protein4 and insulin resi stance in lean,obese，and diabetic subjectsJ.N Engl J Med，2006;354：255263.5 WitkoSarsat V，NguyenKhoa T，Jungers P,et al.Advanced oxidation protein product s as a novel molecular basis of oxidative stress in uraemiaJ. Nephr