重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达.doc

重组人胸腺素1基因在黄芪毛状根中的表达 作者：范伟全 包晓群 韩树海 刘永刚 张宏桂【摘要】 目的 利用黄芪毛状根表达人胸腺素1。方法 合成人胸腺素1基因，构建重组载体pCAMBIA1301hT1，以黄芪下胚轴为外植体，通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中，取潮霉素抗性毛状根用PCR法检测人胸腺素1基因的整合，SDSPAGE、Western印迹法分析人胸腺素1基因的表达。结果 潮霉素抗性毛状根整合并表达了人胸腺素1基因。结论 重组人胸腺素1基因在黄芪毛状根中能够表达，为以黄芪毛状根为生物反应器工业化生产人胸腺素1提供了实验基础。 【关键词】 人胸腺素1；黄芪毛状根；发根农杆菌；重组载体人胸腺素1(human thymosin alpha1，hT1) 是一种强力的免疫增强剂，主要用于自身免疫性肝病、原发性免疫缺陷、慢性乙型肝炎、丙型肝炎、黑素瘤、艾滋病及某些癌症（乳腺癌、肺癌、肝癌、胃肠道肿瘤、恶性黑色素瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、肾癌等）、男性不育症、动脉粥样硬化等免疫缺陷病、免疫抑制性疾病及病毒病和肿瘤的治疗，具有良好的临床疗效1，2。本研究首先构建植物双元表达载体pCAMBIA1301hT1，然后通过发根农杆菌C58C1介导转入黄芪毛状根中，最终在黄芪毛状根中表达人胸腺素1，从而建立以毛状根作为生物反应器生产hT1的方法。1 材料与方法1.1 材料 黄芪种子由中国草地研究所提供；发根农杆菌C58C1和质粒pCAMBIA1301载体由东北林业大学生命科学院惠赠；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，限制性内切酶和连接酶购自大连宝生物公司，Western印迹法分析和其他试剂均购自北京鼎国生物技术公司。1.2 方法1.2.1 载体pCAMBIA1301hT1的构建合成带碱性磷酸酶信号肽的hT1基因片段，5端引入Nco I位点，3端引入Bstb I位点。摇菌提质粒后用Nco I和Bstb I酶切，回收目的片段后连接至pCAMBIA1301载体上。转化E.coli感受态，提取质粒用Nco I和Bstb I酶切，切下150 bp片段，鉴定载体构建的正确性。1.2.2 制备工程菌制备发根农杆菌C58C1感受态细胞，用载体pCAMBIA1301hT1转化感受态细胞，涂板（Rif 50 mg/L，Km 100 mg/L，Sp 100 mg/L），37倒置培养1216 h，挑取单个菌落，提取质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后冻存菌种备用。1.2.3 转化黄芪毛状根1.2.3.1 培养黄芪无菌苗清洗黄芪种子2次，在70% 乙醇中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，然后用0.1%升汞（HgCl2）进行表面消毒8 min后，用无菌水浸洗5次，每次2 min。接种在不含激素的MS（蔗糖3%，琼脂0.8%，pH5.8）培养基上进行无菌萌发，置于(251)植物气候培养箱中，47 d后萌发长出无菌苗。1.2.3.2 培养工程菌 将发根农杆菌在YEB平板上划线培养。挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，28，200 r/min条件下振荡培养，至OD600为0.60.8时按1%量接种于新鲜YEB培养基（pH 5.8），添加乙酰丁香酮（AS）100 mol/L,继续培养至OD600为0.30.5时用于侵染。1.2.3.3 侵染转化毛状根将无菌苗的胚轴纵向划出刀痕，注入工程菌液，1 w左右即可长出毛状根，除菌，潮霉素抗性筛选（500 mg/L头孢霉素，25 mg/L潮霉素，0.3 mg/L IBA的MS培养基），最终获得含hT1基因的黄芪毛状根。1.2.3.4 转化毛状根培养体系的建立将完全除菌后的毛状根切段，转移至MS+0.3 mg/L IBA培养基上(不含抗生素)，置于(251)植物气候培养箱中，隔7 d观察毛状根生长状况，共培养5 w左右。1.2.4 PCR法检测hT1基因在黄芪毛状根中的整合提取黄芪毛状根基因组DNA，PCR扩增hT1基因。上游引物：5AATACCATGGCAGCCGGGAGCA3，下游引物：5GCCTTCGAACTCAGCTCTTAGCAG3。PCR反应体系为50 l，含毛状根基因组DNA 10 ng。94预变性，5 min后进入循环；94变性30 s，58退火40 s，72延伸1 min，30个循环；72延伸10 min，PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.5 SDSPAGE、Western印迹分析取PCR阳性的毛状根各50 mg，按文献方法3提取植物蛋白并进行SDSPAGE电泳，用北京鼎国生物技术公司生产的兔抗hT1为一抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP作二抗进行Western印迹分析。2 结 果2.1 酶切鉴定植物双元载体pCAMBIA1301hT1以构建的pCAMBIA1301hT1双元载体菌种摇菌提取质粒，用Nco I和Bstb I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分析，在150 bp处出现目的条带，见图1，与预测结果相符。完全除菌后的转化毛状根移至液体培养基中黑暗条件下振荡培养，隔7 d观察毛状根的长势，增殖均在50倍以上，见图2。2.2 转化子PCR检测取转化后毛状根提取总DNA，并进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析在150 bp处出现条带，见图3，与预期相符，阴性对照未出现条带，阳性率为43%。2.3 SDSPAGE、Western印迹分析取PCR阳性的黄芪毛状根，提取植物蛋白后进行SDSPAGE电泳，在胶上看到预期的3.2 kD目的蛋白条带。为进一步鉴定该条带的特异性，将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上进行Western印迹分析，结果在3.2 kD附近出现了杂交信号，见图4，而未转化黄芪毛状根没有杂交信号，提示hT1基因在转基因黄芪毛状根中成功表达。3 讨 论 hT1作为免疫增强剂，对治疗免疫缺陷或免疫功能紊乱相关的疾病具有确切疗效4，但其昂贵的价格和安全性问题导致临床使用受限，因此生产安全廉价的hT1是目前临床所急需的。以黄芪毛状根作为生物反应器生产hT1是一条可行的途径，毛状根具有完整的真核细胞表达系统，表达产物可以糖基化、酰胺化，磷酸化等翻译后加工，其表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性，表达产物无毒性和副作用；毛状根生产外源蛋白简单、方便、廉价，发酵生产占用空间小，操作简便；毛状根生长迅速增殖能力强，可在1个月增殖数百至数千倍，生物量巨大5，6。本研究使hT1在黄芪毛状根中成功表达，为利用黄芪毛状根作为生物反应器生产hT1提供了实验基础。 外源基因的表达量是关系到利用毛状根生产药用蛋白是否具有实用价值的一个重要指标7，8。本研究中，转基因毛状根抽提液上清中hT1含量可达140 mg/L。能否通过串联基因、筛选高表达株、寻找强增殖刺激因子等增加目的基因的表达量是进一步研究的课题。为获得目的基因分泌表达，本研究在目的基因前连接碱性磷酸酶信号肽，结果显示，信号肽被正确切割，目的蛋白分泌表达，此信号肽是否具备广谱性有待在其他转基因植物中验证。另外，利用黄芪毛状根作为生物反应器表达hT1的安全性也有待进一步研究，以便为临床试验前期做准备。【参考文献】 1 熊仁平，周元国，刘 苹，等.小牛胸腺素的动物实验及临床应用J.中国生物制品学杂志，2000；13(4)：2414.2 Billich A.Thymosin alpha1 sciclone pharmaceuticalsJ.Curr Opin Investig Drugs，2002；3：698707.3 王关林，方宏筠.植物基因工程M.第2版.北京：科学出版社，2002：1.4 Anatoli G，Sylvestre M，Carola E，et al.Rapid highyield expression of fullsize IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectorsJ.PNAS，2006；103(40)：147016.5 陈 敏，王和勇.发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究进展J.天然产物研究与开发，2000；12(3)：98102.6 罗 玉.利用毛状根的培养生产植物次生代谢物J.云南农业科技，2002；2：402.7 Kathuria S，Sriraman R，Nath R，et al.Efficacy of plantpro