重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定.doc

重组小鼠CK2亚基的GST融合表达、纯化及活性测定 作者：黄雪坤，梁景耀，刘新光，梁念慈【摘要】 目的： 研究重组小鼠CK2亚基在大肠杆菌中的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达和纯化后活性的测定. 方法： 将含有小鼠CK2 cDNA的pGEXGSTMCK2重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，采用谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化，SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳银染鉴定. 将纯化的CK2与CK2以不同的摩尔比混合，找到构成有完全活性的CK2全酶的最佳摩尔比. 用各种已知CK2底物鉴定重组小鼠CK2全酶的性质. 对纯化的CK2和重组CK2全酶进行动力学分析. 结果： 重组质粒转化表达菌经诱导后出现Mr约为38 ku过度表达蛋白，约占菌体总蛋白的31.1%. SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带. 纯化的CK2和亚基等摩尔比混合可组成有完全活性的全酶. 重组CK2全酶的性质与天然CK2一致. 重组CK2全酶对ATP或GTP的米氏常数（Km）值均小于单独CK2，而最大反应速度(Vmax)值均大于单独CK2. 结论： 重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2亚基. 【关键词】 蛋白激酶类；小鼠;原核表达 0引言 蛋白激酶CK2是一种真核细胞中信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 它是由两个催化亚基(或)和两个调节亚基()组成的不均一四聚体1-2，其在细胞生存、生长、增殖及凋亡过程中有很重要的功能. 由于该酶在细胞中的含量较少，提取纯化得到研究所需的量较为困难，因此，克隆并表达重组蛋白激酶CK2，对于深入研究该酶具有十分重要的意义. 我们将含小鼠CK2的pGEXGSTMCK2质粒进行诱导表达、纯化及测定其活性，以探讨重组蛋白激酶CK2是否具有生物活性. 1材料和方法 1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)由卫生部武汉生物制品研究所引进；原核表达载体pGEXGSTMCK2由意大利Semplic博士、教授惠赠；胰蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl D1Thiogalactopyranoside，IPTG)(美国Sigma公司)；谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化试剂盒（瑞典Amersham Pharmacia公司）；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（美国BioRad公司）；32P ATP和32P GTP(北京亚辉生物医学工程公司). 1.2方法 1.2.1蛋白激酶CK2细胞转化、原核表达和纯化将pGEXGSTMCK2转化感受态表达菌BL21,铺入含氨苄青霉素的LB琼脂平板上倒置培养,挑取单菌落加10 mL含Amp的LB培养基过夜振荡培养,次日按500 mL LB培养基加2.5 mL过夜培养菌,一次培养2000 mL,于37剧烈振荡培养,当A595 nm到达0.5时,加IPTG至终浓度为1 mmol/L进行诱导表达. 继续培养4 h后收获细菌,4000 g, 4离心10 min，沉淀用含0.2 mmol/L苯甲基磺酰氟的生理盐水洗涤2次,称湿重，超声破碎,30 000 g 4,离心15 min. 上清按谷胱甘肽琼脂糖珠4B操作说明书进行谷胱甘肽S转移酶(glutathione stransferase，GST)融合蛋白的柱纯化,凝血酶酶切. 1.2.2蛋白激酶CK2的活性测定根据文献3的方法稍加修改. 酶反应总体积为35 L,反应混合液中含50 mmol/L TrisHCl, pH7.2, 150 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2, 50 mol/L ATP,32P ATP或GTP 1.85104 Bq(比活1.851017Bq/mol),去磷酸化酪蛋白2 g/L. 反应温度为30. 加15 L层析收集的酶液启动酶反应,反应10 min后取30 L点至直径2 cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应,阴干,用85 mmol/L磷酸洗涤数次,最后用丙酮洗涤1次,80烤干后,加闪烁液于液闪仪计数. 每收集管做2个平行管测活(但酶性质实验则做3个平行管). 每分钟催化1 pmol32P ATP或GTP上的32P转移到酪蛋白上所需的酶量为1个酶单位. 1.2.3蛋白定量和SDSPAGE蛋白质密度扫描蛋白定量按文献4的方法,以牛血清白蛋白作为标准进行定量. 表达的CK2亚基蛋白占菌体总蛋白的比例则用扫描仪扫描SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳图上相应的泳道，再使用Quanti Scan Demo软件对这泳道上的各种蛋白带进行半定量扫描，得出各种蛋白带的吸光度值（波浪线下的面积代表对应蛋白的质量），将目的蛋白的吸光度值除以各种蛋白带的总吸光度值，从而算出目的蛋白占菌体总蛋白的比例. 2结果 2.1小鼠蛋白激酶CK2亚基在大肠杆菌中的表达重组质粒pGEXGSTMCK2转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后可大量表达出一Mr约为64103的新蛋白分子(图1,泳道2),与GST(Mr约为26103)和小鼠CK2亚基(Mr约为38103)的理论Mr总值相符. 而未用IPTG诱导的表达菌中CK2的过度表达则不明显(图1,泳道1)，说明重组质粒在大肠杆菌中得到了特异高效表达. 图1,泳道2扫描结果表明，表达的融合型CK2蛋白占细菌总蛋白的31.1%左右(图2). 2.2纯化表达产物的分子量经谷胱甘肽琼脂糖珠4B 1步层析柱的分离纯化, SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳的银染结果表明,最终的纯化产物显示出Mr为38103的单一条蛋白带(图3,泳道1),说明分离纯化是成功的. 2.3纯化的表达产物的性质 2.3.1蛋白激酶CK2全酶的构成为了观察原核表达纯化的小鼠CK2基能否与原核表达并经柱层析纯化的小鼠CK2亚基4构成有活性的全酶,将这两种蛋白按不同的摩尔分子比在体外直接简单地混合,结果显示，加入小鼠纯化的重组CK2亚基后CK2的活性明显增加, 在与亚基等摩尔混合后其CK2活性是单独CK亚基活性的近8.7倍, 但再增加CK2的量并不能导致CK2全酶活性的进一步增加(表1). 表1小鼠CK2亚基对CK2亚基酶活性的激活 2.3.2重组小鼠CK2全酶的性质鉴定以酪蛋白、组蛋白和Poly(Glu:Tyr，41)分别作为底物时测CK2全酶活性的结果显示，重组CK2全酶(CK2+CK2)可以将去磷酸化的酪蛋白作为底物，而不能以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物. 以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物时，CK2全酶的活性不到以酪蛋白为底物时的20%. 在以酪蛋白为底物的同时，分别加入肝素、CK2特异性抑制剂5，6二氯1呋喃糖苯并咪唑(DRB)，精胺，Ca2+，cAMP和cGMP后测定CK2全酶的活性的结果表明，重组CK2全酶的活性受肝素和DRB的抑制，能被精胺激活，而第二信使分子的Ca2+，cAMP和cGMP则对CK2的活性没有影响(表2). 2.3.3纯化的单独CK2亚基和CK2全酶(CK2CK2)的动力学根据HanesWoolf作图法作出回归直线,得出的单独CK2亚基对ATP的米氏常数（michaelis constant, Km）值和最大反应速度(maximum velocity，Vmax）值分别为12.6 mol/L和31.0 nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为31.7 mol/L和28.7 nkat；CK2全酶对ATP的Km值和Vmax值分别为3.6 mol/L和155.2 nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为4.3 mol/L和60.0 nkat. 结果表明，CK2亚基和CK2全酶，均可利用GTP作为磷酸供体. 单独CK2亚基显示出对ATP的Km值小于对GTP，而CK2全酶对两者的Km值相似，说明单独CK2亚基对ATP的亲和力大于对GTP，CK2全酶对两者的亲和力相似. 而CK2全酶对ATP和GTP的Km值均小于单独CK2亚基，说明全酶对ATP或GTP的亲和力明显强于单独CK2亚基对ATP或GTP的亲和力，且其活性较单独CK2亚基均有提高. 单独CK2亚基或CK2全酶对ATP的Vmax值均大于对GTP的Vmax值. 表2重组小鼠CK2全酶的性质鉴定 3讨论 蛋白激酶CK2是第一个被发现的蛋白激酶，被认为是21世纪的蛋白激酶和挑战常规的蛋白激酶5，但CK2在体内的真正作用及其机制至今仍是个谜. 目前获得小鼠CK2蛋白存在困难，又缺乏商品化的小鼠CK2抗体. 因此，表达纯化重组小鼠CK2蛋白为进一步系统研究重组小鼠CK2全酶(22，22 或2)的一些基本性质,以及外体筛选以CK2为靶点的药物和制备其功能封闭性抗体，阐明该酶的作用机制具有十分重要意义. 陈小文等6-7的研究初选用原核表达载体pT77,已成功地克隆表达纯化了人CK2，亚基和小鼠CK2，而利用此载体目前还未能获得过度表达的人和小鼠二种CK2亚基，这可能与人和小鼠二种CK2亚基cDNA的5端GC含量比例过高，其mRNA容易形成二级结构有关，从而影响其直接翻译表达. GST融合表达载体pGEX，带有非常强的T7启动子和终止子，其本身表达1个Mr 26 ku GST蛋白，该系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响, 便于融合基因翻译起始，是一种高效的蛋白表达载体，且便于目的蛋白的进一步分离纯化. 我们采用该系统成功地对CK2进行了原核表达，上清经谷胱甘肽琼脂糖4B亲和析柱纯化，得到具有生物活性的Mr 38 ku的目的蛋白，其功能和性质与已报道的CK2性质3和HL60细胞天然CK2一致. 本实验用GST融合表达方法,将不能在原核表达系统高效特异表达的基因成功表达，并且融合蛋白经一步亲和层析纯化即可得到的目的蛋白. 我们的研究结果与陈小文等7表达纯化人CK2亚基要经过磷酸纤维素离子交换柱、多聚赖氨酸2琼脂糖离子交换柱、肝素琼脂糖亲和柱和Sephacryl S200凝胶过滤层析四个步骤相比较，其纯化步骤要相对简单，且纯化成本也相对较低. 因此，本实验对于一些较难克隆表达纯化的基因具有一定的借鉴作用.【参考文献】 1 Raaf J, Brunstein E, Issinger OG, et al. The CK2 alpha/CK2 beta Interface of Human Protein Kinase CK2 Harbors a Binding Pocket for Small MoleculesJ. Chem Biol, 2008, 15(2):111-117.2 Torrecilla I, Spragg EJ, Poulin B, et al. Phosphorylation and regulation of a G proteincoupled receptor by protein kinase CK2J. J Cell Biol, 2007, 177(1):127-137.3 林小聪，刘新光，陈小文，等. 藤黄菌素体外对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用J. 第四军医大学学报, 2006, 27(7):593-595.4 陈小文,郑克勤,梁景耀,等. 小鼠蛋白激酶CK2亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定J. 基础医学与临床, 2003,23