醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定.doc

醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定 作者：刘佳莹, 李淑珍, 李晓玲, 刘莹, 柳晓兰, 高建恩, 仲飞, 孙启鸿【摘要】 目的: 重组表达醛脱氢酶8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1, ALDH8A1）蛋白, 制备其多克隆抗体, 并进行抗体的特异性鉴定, 以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法: 以成人肝cDNA文库为模板, PCR扩增ALDH8A1目的片段, 并构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1, 经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后, 转化大肠杆菌BL21, 诱导表达GSTALDH8A1和 HisALDH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后, 纯化重组融合蛋白, 并以GSTALDH8A1免疫家兔制备抗人ALDH8A1多克隆抗体。用HisALDH8A1包板, ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价; Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性; 免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果: 成功构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1; 获得包涵体形式表达的GSTALDH8A1和可溶性形式表达的 HisALDH8A1融合蛋白; 应用纯化的重组蛋白GSTALDH8A1免疫家兔, 获得兔抗人ALDH8A1血清, ELISA测定抗血清的效价为1256 000。Western blot结果显示, 制备的ALDH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量（Mr）约53 000的ALDH8A1天然蛋白, 与文献报道的ALDH8A1的Mr一致, 表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论: 成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体, 此抗体可应用于ELISA, Western blot和免疫组化检测, 为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础。 【关键词】 ALDH8A1; 重组蛋白; 多克隆抗体ALDH8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1）的基因定位于人类染色体6q23.2, 编码487个氨基酸, 又名ALDH12。ALDH8A1是一个细胞溶质酶, 在体内9顺式视黄酸的生物合成途径中具有重要作用。与全反式视黄醛相比, ALDH8A1是第一个已知的更偏向于9顺式视黄醛结合的醛脱氢酶1, 2, 它能够将9顺式视黄醛氧化为9顺式视黄酸。9顺式视黄酸生物学活性较强, 可通过核维甲酸受体（RAR）结合于DNA应答元件调节靶基因的转录; 尚能与维甲酸X受体（RXR）结合, 在调控细胞生长、 分化、 凋亡等生命活动中起重要作用。ALDH8A1在非酒精性脂肪肝（NASH）患者中呈上调表达, 这可能与其在能量和代谢途径中的氧化作用相关3, 4。我们通过原核表达系统重组表达ALDH8A1蛋白, 免疫家兔, 获得了抗ALDH8A1的多克隆抗体（pAb）, 并进行抗体特异性鉴定, 及ALDH8A1在组织和细胞内的定位。1 材料和方法1.1 材料 成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。大肠杆菌DH5和BL21菌株为本实验室保存。pGEX4T1和pET32a载体购自Novagen公司。DNA聚合酶Ex Taq, 限制性内切酶EcoR和Xho, T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒, 质粒提取试剂盒购自Omega公司。IPTG诱导剂购自Merck公司。雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。弗式佐剂购自Sigma公司。PVDF膜购自Amersham公司。HRP羊抗兔IgG、 poly Helper购自北京中杉金桥公司。ECL反应试剂盒购自Amersham公司。1.2 方法1.2.1 ALDH8A1重组蛋白的表达、 纯化及鉴定 根据Human Protein Reference Database提供的ALDH8A1的氨基酸序列, 应用生物信息学软件DNAstar进行抗原表位分析后, 选取27119 aa片段进行引物设计并重组表达。片段全长279个核苷酸, 在其上游引物设计EcoR酶切位点, 下游引物设计Xho酶切位点, 用成人肝cDNA文库为模板进行PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳并回收扩增的目的片段。回收片段及pGEX4T1和pET32a载体经EcoR和Xho双酶切后, 以适当比例将目的片段分别与两个载体连接并转化大肠杆菌DH5, 阳性克隆经测序证明插入片段序列正确后抽提质粒, 转化大肠杆菌BL21, 诱导表达GSTALDH8A1和HisALDH8A1蛋白并纯化。将纯化的蛋白经SDSPAGE后, 电转移至PVDF膜上。封闭过夜, 加入兔抗GST标签多抗室温孵育1 h, 加入HRP羊抗兔IgG, 室温孵育45 min, ECL显色, 于暗室曝光显影, 用以检测目的蛋白。1.2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的制备 将重组GSTALDH8A1蛋白以生理盐水稀释, 与等体积弗氏完全佐剂充分混匀并乳化后, 每只家兔皮下多点注射800 g; 4周后第2次免疫400 g（后不完全佐剂）; 4周后加强免疫800 g; 1周后颈动脉放血, 于37放置2 h, 4沉淀过夜后, 离心分离血清, 分装后置-20保存。1.2.3 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）ELISA检测ALDH8A1抗血清效价: 检测板用HisALDH8A1融合蛋白（1 mg/L）包被, 每孔100 L, 4过夜。每孔加入200 L封闭液, 37封闭2 h。每孔加入100 L以14梯度稀释的抗血清（阴性对照为正常兔血清, 空白对照为封闭液）, 37孵育30 min。加入HRP羊抗兔IgG, 37孵育30 min。TMB显色后, 酶标仪450 nm处读值。（2）Western blot检测兔抗人ALDH8A1 pAb与重组蛋白和天然蛋白的反应特异性: 将重组HisALDH8A1蛋白、 成人肝匀浆总蛋白及多种肿瘤细胞总蛋白经SDSPAGE后, 电转移至PVDF膜上。封闭过夜后, 加入兔抗人ALDH8A1 pAb, 以正常兔血清作为阴性对照, 室温孵育1 h, 加入HRP羊抗兔IgG, 室温孵育45 min后, ECL显色, 于暗室曝光显影。（3）免疫组化鉴定: 将人肝癌组织石蜡切片脱蜡后, 滴加30 mL/L H2O2处理10 min。在抗原修复盒内以0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液保持9298, 持续15 min。滴加正常羊血清37封闭30 min, 加入ALDH8A1兔多抗, 4孵育过夜。滴加poly Helper, 37孵育30 min, 增加组织通透性。加入HRP羊抗兔IgG, 37孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 封片。2 结果2.1 ALDH8A1重组融合蛋白的表达、 纯化及鉴定 经PCR扩增得到了ALDH8A1目的片段, 分别构建GSTALDH8A1和HisALDH8A1质粒, 并转化大肠杆菌BL21。经 IPTG诱导后, 分别表达出包涵体形式的重组GSTALDH8A1和可溶性形式的重组HisALDH8A1蛋白, 其Mr分别为36 000和29 000, 与预测的ALDH8A1融合蛋白Mr相一致, 经纯化后蛋白纯度均高于80%。通过Western blot鉴定, 重组GSTALDH8A1蛋白可被抗GST标签的抗体识别, 重组HisALDH8A1蛋白可被抗His标签的抗体识别（图1）。图1 ALDH8A1融合蛋白的Western blot分析（略）1: GSTALDH8A1融合蛋白; 2: HisALDH8A1融合蛋白.2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）用重组HisALDH8A1蛋白包被检测板, ELISA检测兔抗人ALDH8A1血清的效价为1: 256 000。（2）Western blot结果表明, 兔抗ALDH8A1血清与BL21空菌对照（图2, 泳道1）无反应; 与重组HisALDH8A1蛋白（图2, 泳道2）及GST标签蛋白（图2, 泳道3）有反应, 所识别条带的Mr分别为29 000与26 000, 证明兔抗血清中包含了抗目的蛋白ALDH8A1及标签蛋白GST的抗体。另外, 兔抗血清可以识别正常成人肝总蛋白中Mr为53 000的蛋白（图2, 泳道5）, 这与文献报道的ALDH8A1天然蛋白Mr一致。以293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞系总蛋白作为抗原, ALDH8A1抗血清作为一抗进行Western blot检测, 结果显示, 在53 000处均有明显条带, 证明ALDH8A1兔多抗能够识别多种肿瘤细胞系中的ALDH8A1天然蛋白（图3）。（3）免疫组化结果表明, 以人肝癌组织切片进行检测, 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体识别的抗原定位于肝癌细胞胞质内（图4）。图2 兔抗人ALDH8A1抗血清的Western blot分析（略）1: E.coli BL21对照; 2: HisALDH8A1融合蛋白; 3: GST蛋白; 4: 成人肝脏总蛋白; 5: 成人肝脏总蛋白图3 用Western blot分析兔抗人ALDH8A1血清对不同肿瘤细胞蛋白的识别（略）1: 293T细胞裂解蛋白; 2: A549细胞裂解蛋白; 3: HeLa细胞裂解蛋白; 4: U937细胞裂解蛋白; 5: HepG2细胞裂解蛋白图4 免疫组化检测ALDH8A1在肝癌组织中的表达（略）A: 人肝脏正常组织; B: 人肝脏癌变组织3 讨论 ALDH8A1蛋白的Mr约为53 000, 含有487个氨基酸, 含有23个不变氨基酸和4个保守区域, 以及ALDH家族具有代表性的半胱氨酸残基。该蛋白在成人肝及胎肝、 肾脏中表达量较高, 这可能与9顺视黄醇高度集中在这两个器官有关5。近年来, 有报道指出, 9顺视黄酸能够诱导肿瘤细胞凋亡, 而ALDH8A1则是9顺视黄醇转化为9顺视黄酸最为关键的酶, 调节了视黄醇的分配, 并维持着机体视黄醇的平衡。在已知的维甲酸类化合物中, 只有9顺视黄酸既能与核维甲酸受体又能与核维甲酸X受体结合发挥其生物学效应, 从而影响细胞DNA的合成, 改变细胞周期和信号传导途径, 还可以影响某些癌基因及细胞因子基因的表达。 本研究中, 我们通过抗原表位分析, 选取了ALDH8A1的27119aa, 以原核表达系统重组表达了GSTALDH8A1和HisALDH8A1融合蛋白, 并以GSTALDH8A1为免疫原, 以HisALDH8A1为检测原, 成功制备了兔抗人ALDH8A1多克隆抗体。对其进行特异性鉴定, 结果表明兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够特异地识别重组表达的ALDH8A1蛋白, 并能够特异地识别成人肝总蛋白中以及多种肿瘤细胞蛋白中的ALDH8A1天然蛋白。免疫组化结果显示兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够与人肝癌组织呈阳性反应。所制备的兔抗人ALDH8A1多克隆抗体对ALDH8A1具有很好的特异性识别, 可应用于ELISA、 Western blot及免疫组化的检测。该抗体的获得可为进一步研究 ALDH8A1在NASH等多种代谢疾病的发生、 发展过程中确切的分子机制提供必要的工具。【参考文献】 1 Jiang J, Best S, Menzel S. cMYB is involved in the regulation of fetal hemoglobin production in adultsJ. 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