《基因工程育种》PPT课件.ppt

第八章 基因工程育种,第一节 基因工程育种概述 第二节 重要的工具酶 第三节 常用的载体 第四节 基因工程育种基本过程 第五节 基因工程育种的应用,主要内容,第一节 基因工程育种概述,Cohen和Boyver l973年首次成功完成了DNA分子的体外重组实验，宣告基因工程(gene engineering)的诞生，也为微生物育种带来了一场革命。,基因工程育种,广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。,基因工程育种的优势 与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，人们可以“随心所欲”地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。,第二节 重要的工具酶,工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。,一、限制性核酸内切酶(RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据限制酶的作用特性，一般分为三类： 、和型， 其中常用的是型限制酶。,限制酶（型）识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口： 5粘性末端 3粘性末端 平头末端 回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称; 粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出或3末端突出的碱基序列，相互具有互补性。,其它特殊性质 的型限制酶,同裂酶（异源同工酶） 同尾酶 可变酶,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。,同裂酶同识同切,同 尾 酶,同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。,可变酶,可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的， 并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如， Bstp，其识别顺序为GGTNACC。,常用限制性核酸内切酶的特性,二、DNA聚合酶,（最常用的DNA聚合酶有以下4种） DNA聚合酶 DNA聚合酶大片段Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶, DNA聚合酶,E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 53DNA 聚合酶活性 53核酸外切酶活性 35核酸外切酶活性,DNA pol 应用, 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； 第二条cDNA链的合成； 对DNA3突出末端进行标记； DNA序列分析。,E. coli DNA pol 催化切口平移, Klenow片段（DNA pol.大片断）,Klenow片段用途, 补齐双链DNA的 3末端； 用标记碱基补 齐3末端 ；, 在cDNA克隆中， 用于第二股链 的合成； DNA序列分析。, Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）,作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75， 2） 95以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,三、逆转录酶,特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： 以单链RNA 为模板， 催化合成cDNA单链 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,逆转录酶的应用： 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； 补平和标记5-末端突出的DNA片段； 代替Klenow酶用于DNA序列分析； 制备杂交探针等。,四、DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接起来 5- ACG AATTCGT-3 T4DNA连接酶 5-ACGAATTCGT-3 3- TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 （2） 修补带有缺口的双链DNA分子,五、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。 用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用 将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。 应用 探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32, 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,重要的工具酶,第三节 常用的载体,载体(vector) 是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA 。,载体必须具备的基本条件 载体的种类 常用的载体,一、载体必须具备的基本条件, 有自身的复制子，能独立复制 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点) 具有遗传表型或筛选标记 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。,二、载体的种类,（一） 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性： 能够在受体细胞复制； 带有药物抗性基因，便于筛选； 可导入受体细胞。 （二）表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件转录和翻译所必须的DNA顺序。,三、常用的载体,（一） 质粒 (plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数 2. 具有1个以上的遗传标志，便于筛选 3. 具有多克隆位点,广泛应用的质粒： pBR32质粒、pUC系列等,pBR322质粒, 4363 bp 含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素标 记(ampR) 一个抗四环素标记 (tetR) ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入 当外原基因插入抗药基因位点时，AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS).,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体； （1） 2674bp； （2） 有ampr和与M13噬菌体 相同的多克隆位点（MCS） （3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断, 编码半乳糖苷酶,(二)噬菌体,组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。,第四节 基因工程育种基本过程,基因工程原理,一、目的基因的获取（分）,目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。,基因工程育种基本过程,1、获取,目的基因来源 1） 制备基因组DNA 2） 制备cDNA 3） 聚合酶链反应 4） 人工合成基因,二、 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法,2、重组,三、重组DNA导入宿主细胞（转）,重组DNA导入宿主细胞的类型 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。,四、重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组DNA的阳性克隆）,筛选一般有下列几种方法： 1 平板筛选 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术,插入失活 蓝白筛选,1 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 1） 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。,抗生素平板筛选（插入失活）,2）蓝-白斑筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。,载体：编码-半乳糖 宿主： 编码-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列,互补,细菌表达： -半乳糖苷酶活性蛋白,5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） 形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行互补产生白色菌落。,（IPTG 存在下）,蓝白筛选示意图,2. 限制性内切酶图谱鉴,3. PCR筛选重组体 抽提少量重组DNAPCR扩增电泳鉴定序列分析。,4. 原位杂交,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 克隆基因的表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列所中断; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别; mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,5、克隆,第五节 基因工程育种的应用,(一)通过基因工程方法生产药物 1治疗用药物 主要是活性蛋白质和多肽类药物，如人干扰素、人胰岛素、人白细胞介素、人生长素、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、集落刺激因子、血小板生长因子、凝血因子等。 2疫苗 如甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、疟疾疫苗、伤寒及霍乱疫苗、避孕疫苗等。 3单克隆抗体及诊断试剂 如前列腺磷酸酶、T细胞及其亚群、狂犬病毒、风