细胞色素c的制备与测定课件

细胞色素C 的制备与测定,细胞色素C的性质,细胞色素（Cytochrome）是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，广泛存在于自然界，在各种动物，植物组织和微生物中都能找到。在生物氧化过程中，细胞色素是重要的呼吸传递体。细胞色素C（Cytochrome C）又称细胞色素丙，,简称细丙。主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。所以制备中多采用心肌和酵母作为提取分离细胞色素C的原料。,细胞色素C是含铁卟啉的结合蛋白质。铁卟啉和蛋白质部分的比例为1:1。由碳、氢、氧、氮、硫、铁6种元素组成。牛、马、猪、人心的细胞色素C蛋白质部分均由104个氨基酸组成，其中只有数个氨基酸不同，氨基酸中含有较多,的精氨酸，故呈盐基性。猪心肌的细胞色素C含铁量为0.38 0.43，相对分子质量12200，等电点pI为10.210.8。细胞色素C的结构中的辅基通过卟啉环上乙烯基的-碳和酶蛋白的一SH基按1:1连接成硫醚键，其连接方式见下图。,图 细胞色素C的结构式,细胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它可分为氧化型和还原型两种。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应。,R 一Fe3+ RFe2+ 氧化型细胞色素C 还原型细胞色素C,这里R代表细胞色素C分子中铁原子以外的卟啉蛋白部分。从以上反应式可见，当细胞色素C分子中的铁原子为三价时(Fe3十)，是氧化型的，但接受一个电子后变成二价铁（Fe2+），成了还原型的细胞色素c分子，电子一旦给出后又成了氧化型的。两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。,细胞色素C对热较稳定，不易变性，在pH 7.210.2时，加热至100 3min，变性才1828%。对酸碱比较稳定，可抵抗0.3molL HCl和0.1mol/L KOH的长时间处理。但三氯醋酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。,其还原型较氧化型稳定，不易与一氧化碳（CO）、氰化钾（KCN）结合，故一般都制成还原型，比较稳定，易保存细胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低温保存，亦可保存于硫酸铵溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成冻干粉末，可保持活性数年。,细胞色素C的临床作用,细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细胞恢复正常呼吸，病情得到缓解,或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。,如用细胞色素C治疗脑血管障碍、脑软化、脑出血、中风后遗症、脑动脉硬化症、脑外伤、婴幼儿百日咳、脑病、不可逆休克期缺氧、脑栓塞、脑震荡后遗症、乙型脑炎的神经精神症状、心代偿不全、心肌炎、狭心症、白喉心肌炎、肺心病、心绞痛、,心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺气肿及支气管扩张引起的呼吸困难、一氧化碳中毒、安眠药中毒、麻醉前处理、新生儿假死、神经麻痹症等。对抗癌药物引起的白血球降低、四肢血行障碍、肝疾患、肾炎等亦有一定疗效。,细胞色素C(Cyt.C)的制备及含量测定 每组称心肌碎肉150g，加自来水300mL（水预先用67mL 1mol/L H2SO4 酸化） 用1mol/L H2SO4调pH3.8 4.0（需不断调整） 搅拌提取1.5h 用1mol/L NH4OH调pH6.0 用四层纱布挤压过滤，收集滤液（暗紫色，浑浊），肉渣回收 用1mol/L NH4OH调pH7.5 8.0，静置1030min，使溶液分层 虹吸上部溶液，过滤除杂质，下部浑浊液离心（4500rpm，5min）, 每人称人造沸石4g 合并清液 浮选 平均分成两份 自来水装柱 上样（流速不大于10mL/min） Cyt.C吸附，沸石呈红色，流出液为黄色（或浅红色） 依次用30mL自来水、去离子水、 0.2% NaCl、去离子水洗柱 用25% (NH4)2SO4洗脱（流速小于2mL/min）, 收集红色洗脱液，量体积（控制在10mL左右） 每100mL洗脱液加17g固体(NH4)2SO4，边加边搅拌至(NH4)2SO4完全溶解，并有沉淀析出 将溶液置于小试剂瓶中，室温静置一周 （接上周） 滤纸过滤，收集滤液，量体积 按8% 体积滴加20% TCA，边加边搅拌 Cyt.C形成可逆沉淀，立即离心（45000rpm，5min），收集 沉淀,若上清液仍为红色，倒出后再补加5% 体积的TCA，再次离心，收集沉淀 Cyt.C沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过5mL） 溶解液装入透析袋 对自来水、去离子水透析，用Ba(Ac)2检测透析袋周围水的SO42- 过滤除去不溶物,得到Cyt.C粗品液，量体积，测定其含量,取5支试管，按以下步骤操作：,注明：依样品液颜色深浅适当增减所取样品液的体积，用dH2O补足4mL，使样品管与标准管颜色相近，以减少误差。,计算总含量（75g心肌）,分别取2号与