兽医微生物课件

新城疫病毒 Newcastle disease virus ( NDV ）,Lecture 10,NDV是禽副粘病毒I型，为不分节段单分子负链RNA病毒。 属于副粘病毒科，副粘病毒亚科。原被归为副粘病毒属，1993年被划为腮腺炎病毒（Rubuluvirus）属。现称为Avulavirus病毒属 副粘病毒科中NDV是唯一的一个其宿主不是哺乳动物而是鸟类的一个成员。,新城疫病毒的存活能力,NDV病毒粒子大致呈球形，有囊膜，直径为100-500nm。病毒粒子表面有长约8nm的纤突。 NDV可凝集所有两栖动物、爬行动物和禽类的红细胞。 血凝特性和抗血清的特异性血凝抑制是ND的有效诊断手段。,致病性：高致病性（速发型）、中致病性（中发型）无致病性（缓发型）三种。 临床：嗜内脏速发型、嗜神经速发型、中发型、缓发型和无症状嗜肠型五种。,OIE根据NDV致病性实验所提出的5个判定标准： 最小致死量病毒致死鸡胚得平均时间（MDT） 1日龄雏鸡脑内致病指数（ICPI） 6周龄鸡静脉致病指数（IVPI） 病毒凝集红细胞后的解脱速率 病毒对热（56，30分钟）的稳定性 NDV的结构多肽、寡核苷酸指纹图谱及与植物血凝素结合能力不同等指标也有助于NDV的分类。,实验方法 强毒力株 中等毒力株 低毒或弱毒株 MDT 4060 6090 90，一般45天 ICPI 1.62.5 0.61.5 0.00.5 IVPI 1 0.00.8 0.0 V 慢 快 快 S 1520 5 5 注：MDT，最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间；ICPI，1日龄雏鸡脑内注射致病指数；IVPI ，6周龄鸡静脉内注射致病指数；V，病毒凝集红细胞后解脱速率；S，病毒血凝集对热的稳定性（56，min）,I am NDV !,新城疫病毒的基因结构 目前NDV的基因组全长有15186bp和15192 bp两种 (6x) 依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因， 即3-NP-P-M-F-HN-L-5 分别编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。,Genome of NDV and functions,Full-length of genome: is only 15186 bp?,NP,NDV基因组3端含有55nt或56nt 5端分别114nt的引导序列（Leader sequence）与尾随序列（Trailer sequence)。,NDV 6个结构基因之间由不同长度（1-47nt）的基因间隔区分开，基因间隔区的作用可能是参与上一个基因mRNA转录的终止及下一个基因的转录起始。,NP蛋白,病毒RNA由2200-2600个NP蛋白亚单位所包围，结合成螺旋对称的核衣壳，可防止细胞内一些核酸酶的降解。 Binding to viral RNA, involving in replication and transcription.,P蛋白,P蛋白与L蛋白一起形成对转录和复制起重要酶活性的RNA依赖的RNA聚合酶 。 P蛋白与L蛋白和NP蛋白一起形成RNPs参与基因组的复制和转录。 P: Preventing of “illegal-assembly” of NP with genomic RNA.,RNA的编辑,P基因在转录过程中通过在484位保守的编辑位点（UUUUUCCC）插入一个或两个非病毒序列的G碱基造成编码框改变而分别产生V和W蛋白 。 P、V和W蛋白具有共同的N末端但C末端不同。 V蛋白具有抑制/干扰素（IFN-/）的作用，是IFN的拮抗蛋白。最近，利用反向遗传操作技术通过构建各种V基因突变毒株，也均证实V蛋白具有抑制IFN反应的能力，同时研究表明V蛋白也是NDV重要的毒力因子，与NDV的致病性密切相关 。,M蛋白,M蛋白位于病毒囊膜的内侧面,M蛋白在病毒的组装等方面起着重要作用。 M蛋白至少有两个功能区,一个是蛋白在脂质双层膜上的嵌着部位,另一个区域与核心中的核衣壳结构互相作用。,F蛋白,F蛋白一级结构中含有三个强疏水区 F蛋白刚合成出来时均为不具有活性的F0前体 F0被裂解后，形成F1、F2两个亚单位，两者以二硫键连接，其结构为NH2-F2-S-S-F1-COOH，裂解出的F1 N端是一个疏水区，能促使病毒与细胞膜融合,Ballagi等于1996年提出了基因型的概念。将F基因约75%的基因片段（即第334-1682位核苷酸）扩增后，用三种限制性内切酶（HinfI、BstOI 、RsaI）进行酶切电泳，根据酶切电泳的图谱特征，将NDV各毒株分为不同的型。,根据基因分型的方法，现已将世界各地NDV分为九个型（-）。且每一型中又可分为不同的亚型，如基因型可分为a、b、c等。研究发现，我国大陆现今的NDV流行株在基因型上主要是基因d。,NDV强毒株 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 NDV弱毒株 而且强毒株的F1多肽的氨基端一般为苯丙氨酸残基，相反弱毒株的该残基则被亮氨酸所取代 。,NDVF蛋白裂解位点的Aa分布情况,成熟的HN蛋白是由亚单位之间通过二硫键最终结合成四聚体寡聚蛋白。 HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性，前者负责识别靶细胞中含唾液酸的受体，介导病毒对靶细胞的吸附；后者则具有破坏分解受体的能力。,HN蛋白,HN蛋白,HN蛋白的大多数功能位点和神经氨酸酶活性点等主要位于球状区。 Hulslander等于1999年分析发现，在HN蛋白柄部含有2 个HR，在74110位残基内，HR内的氨基酸突变后，病毒的融合活性明显下降。,HN蛋白,尽管各毒株HN基因全长均为2.0kb，但由于开放阅读框架长度和终止密码位置的差异，其翻译的多肽长度有所不同。 一类为HN0616，长度为1848bp无活性的前体，需经水解才能转化为有生物活性的HN蛋白，第二类为HN577，第三类为HN571 ，具有生物学活性 。,HN蛋白,NDV的部分生物学特性,L蛋白是高分子量的RNA依赖性RNA聚合酶，与NP和P蛋白共同参与病毒RNA的转录和复制。 L和P 蛋白是RNA依赖性RNA聚合酶的两个亚单位。,L蛋白,Replication of NDV,“Rule-of-six”,强弱毒的研究进展,吉长庆等针对我国流行的NDV强毒株F蛋白前体F0的F2片段的特异结构，人工合成特异性多肽，将其与小牛血清白蛋白化学偶联制成完全抗原，然后免疫小鼠制备多肽血清，该多肽可与新城疫强毒发生特异性反应。,1.抗体法,卢建红等用抗NDV的单抗建立了夹心ELISA从泄殖腔检测新城疫强毒 。 卢景良等用F的重组质粒和纯化的F蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，获得了4株有强毒特异性的单抗，从而为NDV的鉴定和疾病的诊断提供了新的方法。,2.核酸探针法,Jaracki-Black针对NDV F0蛋白及其裂解位点核甘酸序列与毒力的关系，合成区分NDV强弱毒株的核酸探针，该探针的长度为21个碱基，与强毒株的F蛋白裂解位点基因互补可与11个速发性毒株、5个中发性毒株的RNA杂交，而不与所有7个弱毒株的RNA杂交，说明该探针能将弱毒株从强毒和中毒中区分出来。,贺东生等根据F0基因高变区的特异位点，设计并合成了一段含48 bp的寡核苷酸，经光生物素标记后制备探针，用来鉴别新城疫的强毒株和弱毒株。,3. 核酸酶切图谱和序列分析法,2000年Nanthakumar 等利用BglI和HhaI消化F基因中一段含裂解位点编码序列的356bp片段进行酶切分析，可将8 株印度的NDV分离物分为强、中、弱三种毒力。 NDV F蛋白裂解位点序列已经被接受为病毒毒力评定的指标， 1995年Seal等设计了两对引物进行RT-PCR扩增，然后对PCR产物直接测序，对照已发表的强弱毒株序列推测NDV毒力获得了成功。,4 .RT-PCR法,1997年Kant等建立了快速区分NDV强毒和弱毒的RT-PCR方法，他们根据决定毒力的F0蛋白裂解区域的编码基因的差异，设计了A、B、C、D四条引物 。 引物A是上游引物，位于F基因编码F0蛋白裂解区域基因的上游，引物B、C、D是下游引物。,4.RT-PCR法,引物B位于F基因编码F0蛋白裂解区域基因的下游，而引物C、D则针对F基因编码F0蛋白裂解区域基因，引物C特异性针对强毒，引物D特异性针对弱毒。 A+B能特异性扩增出所有NDV F基因 ，引物对A+C能特异性扩增出强毒NDV F基因 ，引物对A+D能特异性扩增出弱毒NDV F基因 。,1.株(A+C);2.株(A+D);3.489株(A+D);4.489株(A+C);5.Mark ;6.株(A+B);7.489株(A+B) 标准强毒株和弱毒株的 扩增图谱,NDV作为新型病毒载体的研究,优点,1、NDV不易发生突变，在研究和生产过程中发生的重组的几率很低； 2、NDV可在鸡胚中大量增殖并可达到较高的滴度，因此适合于外源蛋白的规模化生产； 3、NDV重组疫苗可采取饮水、喷雾等方式免疫，操作相对简单易行；。,优点,4、与其他很多RNA病毒一样，NDV在细胞浆中复制，不依赖细胞核，因此不会与细胞染色体发生整合，使用上相对很安全 5、与其它很多禽类传染病病原一样，NDV的自然感染途径主要是呼吸道和肠道，因此可有效地引发黏膜免役和体液免役，即使在有母源抗体的情况下，也可诱导产生局部免疫。 6、有效的激发体液免疫和细胞免疫,Leader,Trailer,NP,P,F,HN,L,3,5,CAT,GFP,M,HA,CAT,SEAP,Recombinant NDV as a vector,Reporter gene,GS,GE,Construction of recombinant chimeric NDV,Marker vaccine,NP,Leader,Trailer,M,P,F,HN,L,3,5,2001年，