抗生素类药物的分析

抗生素类药物的分析,第十一章,第一节 概述,抗生素的定义antibiotics,抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。,抗生素的来源,1. 生物合成（发酵）,2. 化学合成或半合成,特点：化学纯度较低, 同系物多，异构体多，降解物多；活性组分易发生变异；稳定性差。 鉴别方法：生物学法，理化方法 特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌，组分分析 ，聚合物等。,抗生素质量的复杂性,产品稳定性差,分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,发酵过程不易控制易受污染,生产工艺复杂,发酵液中杂质,无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质,含量测定方法,（一）生物学方法,测定抗生素抑菌或杀菌的能力,测定方法：稀释法，比浊法，管蝶琼脂法扩散法。 比浊法和管蝶琼脂法扩散法为国际通用法。 中国药典采用管蝶琼脂法扩散法。,1、与临床效果一致 2、灵敏度高 3、干扰物质少,1、操作繁琐 2、培养时间长 2、测定误差大,优点,缺点,通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。其原理恰好与临床应用要求一致，更能确定抗生素的医疗价值。 对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法是首选的效价测定方法。,（二）化学及物理化学方法,以理化方法测定主药含量,适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素,抗生素活性表示方法,效价：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（u）或微克（g）表示。 各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。 1mg青霉素钠定为1670单位；1mg庆大霉素定为590单位。,分类（按结构与性质）： 内酰胺类、氨基糖苷类、 四环素类、大环内酯类、 氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类 林可霉素类、其他抗生素类,第二节 内酰胺类抗生素,青霉素类,一、化学结构与性质,*,*,*,6-APA,头孢菌素类,*,*,7-ACA,*,*,*,*,*,头孢菌素类,青霉素类,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林 （氨苄青霉素）,阿莫西林 （羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,酸性,结构与性质,一、,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,(5%头孢唑啉钠溶液 1824),头孢菌素类 C6 C7,青霉素类 C3 C5 C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类 母核无明显UV 多数有苯环取代基,UV,青霉素钠UV7-20,（四）内酰胺环,水溶液 不稳定,干燥纯净 稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,例,青霉素的降解反应,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,二、,鉴别,（二）呈色反应,1. 羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,（红、棕、褐）,头孢菌素类,3. 茚三酮反应,-氨基,-氨基、伯胺 某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,4. 双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,蓝紫色,5. 与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素 阿莫西林 氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,6. 与重氮苯磺酸反应,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,7. 与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,（三）沉淀反应,1. 遇酸,在过量HCl或 有机溶剂中溶解,2. 有机胺盐反应,（1）重氮化 - 偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,（2）与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,样品、分解产物,Cu2+,头孢氨苄 max = 262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm = 1.301.50,-内酰胺环,酰胺,对照品对照法,三、特殊杂质检查,特殊杂质主要有：高分子聚合物，有关物质，异构体,控制方法：HPLC法，吸收度,有关物质和异构体:ODS柱,聚合物：采用葡聚糖凝胶G-10(40-120m),聚合物HPLC法 色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10（40120m）为填充剂，玻璃柱内径1.31.5cm，床体积5060mL；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000mL使溶解，调节pH值至7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1mL；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液进样200L进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200L，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。,对照品溶液的制备 取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶100g/1mL的溶液，摇匀。 测定法 取本品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立即进样200L，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200L注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。,自身对照外标法的原理： 该法是利用特定条件下-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物，即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。 以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标； 然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标， 按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。,有关物质和异构体 例1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查： 色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度R1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，n1500。 异构体照含量测定项下方法试验。以A异构体峰的相对tR为1.0，B异构体峰的相对tR约为0.85， 供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。 有关物质按自身对照法测定有关物质限量,2-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得的，其相对tR约为1.2 。,吸收度 如青霉素钠（钾）的吸收度检查： 取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.800.88。 此法中264nm 处吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的量。 头孢氨苄中有关物质的检查反相TLC法 （自学）,四、含量测定,碘量法,汞量法,可见-紫外分光光度法,HPLC,酸碱滴定法,电位络合滴定法,（水解）,水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,ChP,反应分两步进行： 1. 水解反应 (按化学计算量进行) 2. 氧化-还原反应 (无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),第一步,第二步,例,注射用普鲁卡因青霉素 含量测定,取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在2025暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，,至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰 B、消除样品中其他消耗碘的杂 质的干扰 C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环 境等条件的影响 B、使本法测定结果与微生物检定 法一致,（1）弱酸性 pH4.5,碱 I2 IO3- + I-,酸 普鲁卡因与碘在酸性条件 下会产生复盐沉淀,（2）温度 2426,温度38 未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的 变化较小，可减小含量测定的误 差。,（1）灵敏度高,样品 : 碘 = 1 : 8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,原料,（水解）,青霉素族,ChP,电位络合滴定法,样 品,以未经水解的样品作空白测定,例,青霉素钠 含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水 5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml ，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶 液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水 20ml，摇匀，照电位滴定法(附录 A), 用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极 为参比电极，在3540，用硝酸汞滴 定液(0.02mol/L)缓慢滴定，,（控制滴定过程约为15分钟），不计第 一个等当点，计算第二个等当点时消耗 滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02 mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按 C16H17N2NaO4S计算)。 另取本品约0.5g，精密称定，加水 与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完 全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定 液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上.,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当 于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S 计算）。 总青霉素的百分含量与降解物的百 分含量之差值即为青霉素的含量。,（1）以第二次滴定突跃为终点 电位法指示终点,（2）反应摩尔比 1 : 1,（3）空白试验 消除已降解产物干扰,（4）优点 不需标准品,精密称取含水量为0.5%的青霉素 钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含 量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L) 6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g， 按药典方法测定降解物含量时，用去硝 酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干 燥品计算，求样品中青霉素的含量。,例,青霉素钠 含量测定,（钠盐）,-内酰胺类,ChP,中和,中和,例,苯唑西林钠 含量测定,取本品约0.5g，精密称定，加新沸过的并用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和至酚酞指示液刚显红色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和后，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，摇匀，置水浴中加热20分钟，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，加酚酞指示液12滴，用盐酸滴定液,（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于40.14mgC19H19N3O5S。,（1）水解前先中和溶剂和样品,（2）加热时避免吸收CO2,不能使酚酞变红,（3）空白试验校正(消除Na2CO3干扰),（水解）,可见-紫外分光光度法,（四）,（1）原理,稳定剂,JP,青霉素族,（2）方法,（3）特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,（4）计算,（1）原理,（咪唑）,青霉素族,ChP,（2）方法,对照品法,计算,pH 9,例,氨苄西林钠 含量测定,取本品约60mg 置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液（150）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置60水浴中，加热30min，取出冷却，,照分光光度法（附录 A ），在325nm的波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物标准品，按同法测定，计算，即得。,（3）讨论,a. 咪唑催化的水解产率高，硫 醇汞盐稳定（3h）,b. 侧链有-NH2时，需加醋酐先 将其乙酰化后才能发生上述 反应,（4）特点,A、简便快速 B、用标准品对照，重现性良 好，RSD1%,USP JP,红色,-内酰胺类,NaOH,ChP 头孢菌素类,特点 快速、高效、灵敏 专属性强、重现性好 一法多用（鉴别、检查、含测）,这是-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种，应用HPLC法测定含量的有50多种，约占78%。 本类药物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外标法计算含量。,哌拉西宁 原料药 含量测定 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。,第三节 氨基糖苷类抗生素,链霉素 双氢链霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 巴龙霉素,链霉胍 + 链霉糖 + N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,绛红糖胺 + 脱氧链霉胺 + 加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3- 去氧-4-甲 基戊糖胺,庆大霉素C复合物 庆大霉素C1 R=H R1、R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R、R1、R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H 庆大霉素C2b R=R1=H R2=CH3,巴龙霉素,多与硫酸成盐,碱性,（一）,链霉素 pH57.5 庆大霉素 pH212,链霉素在230nm，庆大霉素等无紫外吸收,羟基胺结构,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,红色,链霉糖特有反应,紫红,麦芽酚,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉, -萘酚,H+,庆大霉素无UV吸收,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法 TLC中的对照品法 （BP）,1. 来源 反应中间体,2、硫酸奈替米星中有关物质的TLC检查： 供试品溶液：150mg / mL； 标准品溶液（1） 1.5mg / mL； 标准品溶液（2） 3mg / mL； 标准品溶液（3） 1.44mg西索米星/mL， 点样：各2L， 展开剂：二氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（4：4：2） 显色：0.2%茚三酮溶液，110加热20min。,结果：供试品溶液如显杂质斑点，其颜色 与标准品溶液（3）所显主斑点相比较，不得更深（1%）， 其他杂质与标准品溶液（1）所显主斑点相比较，均不得更深（1%）， 如有一点超过，应不深于标准品溶液（2）的主斑点（2%）。 注：奈替米星是由西索米星经化学衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能残留西索米星，需进行控制。,发酵菌种不同 工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChP USP BP JP,max = 330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基 异吲哚衍生物,RPHPLC,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,峰面积归一化法,链霉素、庆大霉素,微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养 基内的扩散作用量反应平行线原理 的设计，比较标准品与供试品两者 对接种的试验菌产生抑菌圈的大小 ，以测定供试品效价的一种方法。,五、血清中庆大霉素的HPLC法,血浆样品的预处理 离子对色谱法的目的： 除去氨基酸、肽、胺的干扰 选用OPA为荧光衍生化试剂 采用柱后衍生化法,第四节 四环素类抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四环素（TC）tetracycline,金霉素 (CTC) chlortetracycline,氯四环素,土霉素 (OTC) oxytetracycline,氧四环素,多西环素 (DOTC) doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC） metacycline,多含结晶水,pH3 7.5 荧光,1.,差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,差向四环素,（土霉素、多西环素、美他环素不易差向异构化）,（1）酸性下降解,max = 445nm,max = 435nm,橙黄色,脱水四环素,6,5,10,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,（荧光）,6,11,1mol/L盐酸-甲醇（1100） 0.01mg/ml,UV,正相分配薄层色谱,EDTA 克服痕量金属造成的拖尾现象,中国药典收载的四环素类抗生素中，除土霉素外均采用红外光谱法鉴别,中国药典和USP(29)采用高效液相色谱法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸金霉素等。,4-差向四环素（ETC） 脱水四环素（ATC） 差向脱水四环素（EATC） 盐酸金霉素（CTC）,TLC法（1995版）,HPLC法（2000，2005版）,标准品对照法,盐酸四环素,BP(2005),USP(29)HPLC,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,吸收度,（二）,杂质吸收度,ChP、USP,HPLC法（外标法）,系统适用性试验 1. 防护柱 2. 预试溶液 4-差向脱水四环素 四环素 3. RSD2.0%,JP 比色法（标准曲线法）,原理,1. 熟悉抗生素类药物分析的特点及其 常规检验项目。了解抗生素类药物 的分析现状，熟悉生物学法与物理 化学法测定效价的原理及优缺点。 2. 掌握内酰胺类抗生素的结构、 性质、鉴别及含量测定。,第十一章 复习内容,3. 掌握氨基糖苷类抗生素的结构、性 质及鉴别，了解其检查及含量测定 4. 掌握四环素类抗生素的结构及性质，了解其鉴别、检查及含量测定 5. 了解抗生素类药物的质量考察方法,99：89下列哪