三种结核分枝杆菌抗原的抗体联合检测在临床中的应用.doc

三种结核分枝杆菌抗原的抗体联合检测在临床中的应用 作者：崔晓利，姚小红，刘春梅，张增贤 【摘要】 目的：通过结核菌三种抗原脂阿拉伯甘露糖(LAM)、16KDa、38KDa固相于同一膜片上制作的结核蛋白芯片系统联合检测结核患者血清中的相应抗体，以达到快速诊断结核病的目的。方法：收集西安市结核病胸部肿瘤医院痰涂片或者结核菌培养阳性患者的血清98例，痰涂片或者结核菌培养阴性患者的血清54例，结核性脑炎、结核性胸膜炎患者血清20例，通过结核蛋白芯片系统检测三种抗体，任意一种抗体阳性即为结核抗体阳性。结果：活动性肺结核阳性率86.7%(85/98)，痰涂片阴性的肺结核阳性率66.7%(36/54)，结核性脑炎、结核性胸膜炎阳性率45%(9/20)。结论：三种抗原联合使用具有良好的敏感性与特异性，明显优于任何一种抗原单独使用，联合使用将会对结核病的快速辅助诊断起积极作用。 【关键词】 结核分枝杆菌；联合检测；抗原；芯片 结核病是长期以来危害人类生命健康的严重疾患，特别是我们国家患者数约450万，每年病死近20万人。结核病的病原体为结核杆菌，它除了能引起呼吸道感染外，还可引起其他部位的病变，因此，结核病的早期快速诊断对结核病的防治具有极其重要的意义。我们使用基因工程表达的结核菌蛋白16KDa和38KDa以及脂阿拉伯甘露糖(LAM)三种抗原制作的结核蛋白芯片联合检测结核抗体，在临床上取得较理想的快速诊断效果。1 材料与方法1.1 血清标本来源结核患者的血清均来源于西安市结核病医院的住院患者，其中痰直涂或者培养阳性患者98例，痰涂片阴性患者54例，结核性脑炎或者结核性胸膜炎的患者20例。1.2 结核菌多抗原的IgG抗体芯片检测系统 由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供。批准文号：国药准字S20050089。1.3 蛋白芯片阅读仪南京大渊生物技术工程有限公司自主设计生产，型号：PBT-X4。1.4 芯片系统操作步骤在芯片上标记样品编号；在芯片盒窗口内滴加4滴试剂A，使膜表面完全浸湿；待完全渗入后，加入待检血清100ue；待血清完全渗入后，再滴加6滴试剂B；待试剂B完全渗入后，滴加10滴试剂C；待试剂C完全渗入后，最后滴加6滴试剂D；反应完毕后30 min内，将芯片放入芯片阅读系统进行分析。阴阳性结果根据南京大渊生物技术工程有限公司生产的芯片识别仪器设置参数自动判别。2 结果三种抗原的抗体联合测定，任何一种阳性即为结核抗体阳性。痰涂片阳性或者培养阳性的结核患者98例，其中结核抗体阳性85例，阳性率86.7%。痰涂片阴性的肺结核患者54例，其中36例结核抗体阳性，阳性率66.7%。结核性脑炎、结核性胸膜炎患者20例，其中结核抗体阳性9例，阳性率45%。3 讨论检测结核菌抗体用于结核病的诊断一直是结核病基础研究和防治人员追求的目标，而细胞内病原体引起的感染，机体产生的抗体谱是高度多样性的，从不同患者身上采集的血清可能引起不同的抗原产生反应，因此对这些病原体引起的传染病诊断可采取用多种抗原联合检测更多抗体的方法，来提高诊断的灵敏度。结核芯片系统的基本原理是以微孔滤膜为载体，利用微阵列技术将纯化的结核菌LAM、蛋白16KDa和38KDa等三种抗原固相于同一膜片上并利用微孔滤膜的渗滤浓缩、凝集作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色，显色后的芯片放入芯片阅读仪，在专门软件的支持下，对不同抗原点阵的灰度值进行分析。实现了对这三种抗原的抗体进行同步检测，从而对结核菌感染情况作出诊断。在结核患者中，抗结核菌单个抗原的抗体阳性率以抗LAM的阳性率最高为54%，LAM是一种特异的多糖抗原，这种抗原具有较强的抗原性，能够刺激结核菌感染者产生抗体，而其他分枝杆菌由于表面LAM含量低，不能刺激机体产生高水平的抗体量，故抗LAM的特异性和敏感性都较高。38KDa的抗体阳性率次之，为45%，这种抗原是其他分支杆菌所不具有的，人感染结核杆菌后会产生针对此38KDa蛋白质的特异抗体，最低为16KDa的抗体阳性率为39%，16KDa是一种特异的蛋白质抗原，该蛋白质能大大提高实验的灵敏度。每一批结核芯片都有灰度校正光盘，其临界值是不同的，因此不能混用，否则影响结果的准确性，临界值的确定采用最适工作浓度的抗原点样，于一定数量的正常对照血清标本反应后，用芯片识别读数仪测定其灰度值，计算均数及标准差，均数与2倍标准差的和即为临界值，各种抗原与标本中的抗体、金标记二抗反应，得到的灰度值大于或者等于临界值者为阳性，否则为阴性。结核芯片系统联合检测结核菌抗原的抗体，其敏感性高，检测速度快，患者血清分离出来后，只需要5 min就可以出结果，可以单人操作，大大方便了患者，并且结果的判断采用芯片识别阅读仪，避免了人为判读的主观误差。芯片反应窗口的膜不能损伤或受潮，在芯片反应过程中，应避免任何其他物体接触膜表面，以免造成污染，影响结果。标本应为新鲜分离的血清，若是血浆必须剥离纤维蛋白，以免吸入导致膜孔堵塞，溶血标本和高脂血标本对检测结果有影响。对于痰菌阳性而三种抗体均为阴性的这些患者大部分为老年结核病患者，年龄在65岁以上，可能与免疫力低下有关，有个别患者同时用流式细