K252a对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用.doc

K252a对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用 作者：张茂银，陈龙，成勤，张稳稳，刘苏，王光磊，刘功俭【摘要】 目的 观察K252a（MLK3阻断剂）对内毒素性急性肺损伤大鼠肺病理组织学改变及生存率的影响。方法 采用尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）复制内毒素性急性肺损伤模型。90只大鼠随机分为6组（n=15）：对照组(control组)、LPS 组、K252a 50 g/kg组（K50组）、K252a 75 g/kg组（K75组）、K252a 100 g/kg组（K100组）和溶剂对照组（DMSO组）。模型制备成功后6 h取肺脏进行光镜检查，观察48 h内大鼠死亡情况并比较累计生存率。结果 48 h内LPS组、K50组、K75组和K100组以及DMSO组大鼠生存率分别为6.3%、27%、72%、57%及6.7%。光镜下可见LPS组大鼠肺组织结构明显被破坏，主要表现为肺泡内出血、肺间质水肿、肺泡萎陷以及肺组织内大量炎性细胞浸润。与LPS组相比，预先应用K252a组肺组织的损伤程度较轻微、肺间隔轻度增宽、无明显出血、少量炎性细胞浸润，尤其K75组，减轻程度最明显。结论 K252a延迟LPS大鼠死亡时间，并呈现剂量依赖性，75 g/kg K252a剂量可以明显提高其生存率。并可改善内毒素性急性肺损伤大鼠肺脏的病理组织学结果。 【关键词】 K252a;MLK3;内毒素;急性肺损伤；大鼠;生存率 急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见的危重病，是重症监护治疗的重要课题。其本质是以炎症介质过度释放为特征的肺部广泛炎症反应1。由于ALI/ARDS病因与发病机制的复杂性，近年来尽管进行了大量的研究，但其病死率仍居高不下2。因此深入了解并研究ALI/ARDS的发病机制，具有重要意义。本实验采用大鼠尾静脉注射LPS复制内毒素性急性肺损伤模型， 应用p38MAPK上游MLK3的抑制剂K252a对内毒素性急性肺损伤大鼠进行干预， 观察其对大鼠肺脏病理组织学改变及生存时间的影响， 旨在探讨K252a对急性肺损伤有无保护作用，从而为抗炎治疗增添一条新的途径，还有助于寻找对ALI/ARDS更有效的治疗方法。 1 材料和方法 1.1 实验动物及试剂 成年雄性SD大鼠，体重200250 g，购自中国科学院上海实验动物中心。LPS（E.coli，011:B4）、K252a、DMSO（dimethyl sulfoxide，二甲基甲酰胺）均购自美国Sigma公司。 1.2 模型制备和分组 实验动物随机分为6组（n=15）：对照组（Control组），仅注射生理盐水；LPS组，经尾静脉注射LPS 5 mg/kg；K252a 50 g/kg组（K50组）、K252a 75 g/kg组（K75组）和K252a 100 g/kg组（K100组），分别在注射LPS前30 min尾静脉注射K252a 50 g/kg、75 g/kg、100 g/kg；溶剂对照组（DMSO组）在注射LPS前30 min尾静脉注射DMSO 0.2 ml。本实验中所选用药物剂量及给药方式是依参照文献3、4及我们的预实验结果而定。 1.3 病理学检查 注射LPS后6 h取适量肺组织，经4%甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色后，光镜下观察病理改变。 1.4 生存率分析 为了证实K252a对急性肺损伤的保护作用，观察各组大鼠48 h内的生存情况。 1.5 统计学分析 所有数据均以s表示，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Students t检验。死亡率分析采用Kaplan-Meier检验。P<0.05认为有统计学意义。所有统计均由SPSS13.0统计软件处理完成。 2 结 果 2.1 病理学检查 见图1。与对照组相比，LPS组大鼠肺组织的结构破坏明显，主要表现为肺泡内出血、肺间质水肿、肺泡萎陷以及肺组织内大量的炎性细胞浸润（图1-B）。与LPS组相比，预先应用K252a各组大鼠肺组织的损伤程度减轻，表现为肺间隔轻度增宽、无明显出血、少量炎性细胞浸润（图1-D、1-E、1-F），尤其K75组，减轻程度最明显。 2.2 生存率分析 见表1。与LPS组相比，K75组的生存率明显提高(P<0.05)，而DMSO组与LPS组之间的生存率差异无显著性。这表明K252a能够限制LPS的致死率，尤其是75 g/kg剂量组。表1 各组平均生存时间及生存率比较 3 讨 论 ALI/ARDS的发生发展是一个复杂的过程，涉及了许多信号转导途径。在以往的研究中，人们都将注意力放在NF-B信号通路上，因为该通路可以诱导多种炎性细胞因子的表达。然而，ALI/ARDS发生发展是一个复杂的过程，涉及了许多信号转导过程，不仅有NF-B信号通路，还有许多其他激酶通路。近年来，大量的离体研究显示，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族均参与调节了炎性介质的产生，且参与了机体炎症反应的发生与发展。如p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）等，其中，p38MAPK被认为是在应激信号传递中最重要的调节者之一，在调节细胞的凋亡以及细胞因子的产生中发挥着重要的作用。Kim等5曾报道p38MAPK参与调节了人肺血管内皮细胞中TNF-诱导的IL-8的产生。还有证据显示p38MAPK参与了 LPS诱导的中性粒细胞中NF-B的核转位。p38MAPK介导了LPS引起的支气管收缩和中性粒细胞的聚集。 由于p38MAPK的特异性抑制剂SB203580的发现，又为研究p38MAPK的细胞内信号通路提供了一个有效的工具。据报道，在LPS刺激的单核细胞中，TNF-和IL-1的产生与p38MAPK的活化密切相关6。还有报道指出p38MAPK抑制剂SB203580预处理可下调大鼠细胞黏附分子ICAM-1的表达，减轻肺组织的病理损害，能起到防治ALI的作用。最近，又有研究7表明，巨噬细胞的糖皮质激素受体通过选择性抑制p38MAPK来抑制toll样受体介导的炎症反应。此外，p38信号通路还参与了大鼠急性重症胰腺炎所导致的急性肺损伤的发生，抑制p38MAPK， 能明显地降低其肺损伤的程度8。尽管大量研究显示，p38MAPK信号通路对炎症介质的调节起着重要的作用，但是有关p38MAPK信号通路对LPS导致的ALI的调节作用的在体研究还很少，并且，其作用机制也尚未明确。 本实验中我们探讨了人为阻断MLK3-MKK3/6-p38MAPK信号通路对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的影响，选择K252a作为MLK3的抑制剂。本研究发现：K252a能延迟内毒素诱导急性肺损伤大鼠的死亡时间，并呈剂量依赖性，K252a 75 g/kg剂量组可明显提高其生存率，并能明显改善内毒素性急性肺损伤大鼠肺脏的病理组织学结果。提示K252a对内毒素诱导急性肺损伤大鼠有保护作用，其机制可能是：抑制MLK3的磷酸化能有效地阻止LPS引起的肺损伤的级联反应。 在此基础上，我们认为，p38MAPK信号通路的活化可能是急性肺损伤发生发展的机制之一，在信号通路水平阻断和调控MLK3及p38MAPK的表达和活性，将可能成为治疗急性肺损伤的一条新途径。而且尤为重要的是，MLK3抑制剂可能比p38MAPK 抑制剂更具有临床应用前景，其更加强对休克、创伤、感染、炎症的早期处理，以消除产生过度炎症反应的条件，否则一旦病情发展到失控性炎症反应阶段，现有的一切手段都会显得苍白无力。【参考文献】 1 Wheeler AP， Bernard GR. Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: a clinical review J. Lancet，2007，369（9572）:1553-1564.2 Vincent JL， Zambon M. Why do patients who have acute lung injury/acute respiratory distress syndrome die from multiple organ dysfunction syndrome? Implications for management J. Clin Chest Med，2006，27(4):725-731.3 Pan J， Wang G， Yang HQ， et al. K252a prevents nigral dopaminergic cell death induced by 6-hydroxydopamine through inhibition of both mixed-lineage kinase 3/c-Jun NH2-terminal kinase 3 (JNK3) and apoptosis-inducing kinase 1/JNK3 signaling pathways J. Mol Pharmacol，2007，72(6):1607-1618.4 Xu Y， Hou XY， Liu Y， et al. Different protection of K252a and N-acetyl-L-cysteine against amyloid-beta peptide-induced cortical neuron apoptosis involving inhibition of MLK3-MKK7-JNK3 signal cascades J. J Neurosci Res，2009，87(4):918-927.5 Kim HJ， Lee HS， Chong YH， et al. p38 mitogen-activated protein kinase up-regulates LPS-induced NF-B activation in the development of lung injury and RAW264.7 macrophages J. Toxicolgy，2006，225（1）:36-47.6 Li T， Zhao B， Wang C， et al. Regulatory effects of hydrogen sulfide on IL-6， IL-8 and IL-10 levels in the plasma and pulmonary tissue of rats with acute lung injury J. Exp Biol Med (Maywood)，2008，233(9):1081-1087.7 Bhattacharyya S， Brown DE， Brewer JA， et al. Macrophage glucocorticoid receptors regulate toll-like receptor 4-mediated inflammatory responses by selec