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原位杂交法检测肺癌组织中的COX2mRNA 作者：赵兰香 陈岗 李榕 冯久贤 韩宝惠 【关键词】 杂交法环氧化酶（cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸转变为前列腺素和血栓素的限速酶，与机体的各种生理病理过程密切相关:有两种同工酶:COX1、COX2。目前研究认为:COX2是一种诱导酶，直接参与病理状态下，尤其是与炎症过程和癌症的发生过程中有关的前列腺素的生成和转化，通过抑制凋亡、抑制机体的抗肿瘤免疫、促进肿瘤新生血管生成和增加侵袭力参与非小细胞肺癌（NSCLC）的发生、发展和转移。我们采用原位杂交（RNA-RNA）法检测了34例NSCLC患者病理组织中COX2mRNA的表达，评估原位杂交法在临床上的应用价值。1 资料与方法 1.1 一般资料 所有肿瘤标本均系上海市胸科医院2004年手术切除的肺癌标本。患者术前均未接受抗肿瘤治疗。34例患者中男26例，女8例，年龄2976岁，平均60.3岁。鳞癌14例，腺癌18例，腺鳞癌2例。组织学分级:级12例，级16例，级6例。肿瘤直径3cm的12例，肿瘤直径>3cm的22例。以癌旁正常肺组织作为阴性对照，以标准阳性片作为阳性对照。 1.2 试剂和方法 采用武汉博士德生物工程有限公司的COX2原位杂交检测试剂盒的试剂和操作步骤进行检测。主要步骤:新鲜手术标本立即制作成冰冻切片，立即用4%多聚甲醛/0.1MPBS+0.1%DEPC固定30min，干燥后置于-20冰箱内储存。标本用30%H 2 O 2 1份+纯甲醇50份，室温处理30min后蒸馏水洗涤3次，每张切片加20l预杂交液置于恒温箱（3842）内2h，其后每张切片加21l杂交液加盖玻片置恒温箱（3842）内12h，揭去盖玻片，用372SSC冲洗2次，370.5SSC冲洗1次，0.2SSC冲洗1次，然后滴加封闭液并置37水浴箱中30min，滴加生物素化鼠抗地高辛后置37水浴箱中60min，专用PBS（0.02M phosphate，0.5M NaCL，pH7.27.6）洗4次，滴加SABC后置37水浴箱中20min，专用PBS（0.02M phosphate，0.5MNaCL，pH7.2-7.6）洗3次，滴加生物素化过氧化物酶后置37水浴箱中20min，专用PBS（0.02M phosphate，0.5M NaCL，pH7.2-7.6）洗4次。DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。 1.3 结果判断 以细胞膜出现明显的棕黄色颗粒为COX2阳性细胞，根据阳性细胞在同类细胞中所占比例将结果分为3个等级:<5%的细胞呈阳性反应为阴性，5%50%的细胞呈阳性反应为阳性，>50%的细胞呈阳性反应为强阳性。 1.4 统计学方法 用SPSS10.0统计软件计算，采用 2 检验，P<0.05表示差异有显著性。 2 结果在34例NSCLC中有22例COX2阳性，阳性率为65%，其中强阳性2例，阳性20例。在14例鳞癌中COX2阳性9例，强阳性1例，在18例腺癌中COX2阳性10例，1例腺鳞癌COX2阳性，1例腺鳞癌COX2强阳性。所有癌旁正常肺组织COX2均阴性。阳性结果见图1。该结果表明在大多数非小细胞肺癌组织中存在COX2mRNA的过度复制，而且与肿瘤类型、大小、分化程度、患者年龄无关。 3 讨论近年来肺癌的发病率和病死率迅速上升，跃居肿瘤第一位。虽然治疗技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善 1 ，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移。预防并控制远处转移是肺癌治疗中亟待解决的问题。目前的研究认为COX2与肿瘤的发生、发展，转移和预后有关，通过抑制凋亡、抑制机体的抗肿瘤免疫、促进肿瘤新生血管生成和增加侵袭力参与NSCLC的发生、发展和转移，是NSCLC预后不良的独立预测指标 2 。COX2抑制剂可以提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性 3 ，放化疗与COX2抑制剂的联合应用有助于延长NSCLC患者的生存期。原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术己被广泛应用 4 ，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便;同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出它们之间的相互关系及功能状态。肺癌中COX2的检测多采用免疫组化法，采用原位杂交法检测者较少，Khuri 5 的实验结果表明COX2在NSCLC中的总体阳性率为60%，与本文结果相近。原位杂交法的关键在于组织取材尽可能地新鲜并要很好的防止污染，本研究采用冰冻切片很好的解决了组织新鲜的问题。冰冻切片立即固定可以保持细胞结构和细胞内的基因不降解。实验所用玻璃器皿均高温烘烤，实验中戴消毒手套操作有效地防止了污染。采用冰冻切片无需蛋白酶消化也能取得满意的实验结果，而石蜡切片需要蛋白酶消化，时间在330min，根据我们体会在2030min内效果较好，肿瘤细胞未被消化，结构良好而且mRNA暴露充分。另外，探针浓度可以影响杂交结果，用不经稀释的探针可以使无病变组织呈现假阳性，用预杂交液稀释探针可以减少非特异性结果。在杂交后用SSC冲洗玻片时增加0.2SSC冲洗对减少非特异性染色有较好效果，建议列入常规操作。由于COX2作为靶向治疗的热点之一日益得到人们的重视，故NSCLC中COX2表达情况的检测也随之得到人们的重视。原位杂交法检测NSCLC冰冻切片中COX2mRNA的过度复制率可能有助于NSCLC患者预后的判断。（本文图片见封三）参考文献 1 Parkin DM，Bray FI，Devesa SS.Cancer burden in the year2000.The global picture.Eur J Cancer，2001，37（suppl8）:S4-S66.2 KimHS，YoumHR，Lee JS，et al，Correlation between cyclooxygenase-2and tumor angiogenesis in non-small cell lung cancer.Lung Cancer.2003，42:163-170. 3 Hida T，Kozaki K，Muramatsu H，et al.Cyclooxygenase-2inhibitor induces apoptosis and enhances cytotoxicity of various anticancer agents in non-small cell lung cancer ceIl lines.Clin Cancer Res，2000，6:2006-2011. 4 金中元，程瑞雪，郑长黎，等.原发性肝细胞癌中PTTG和c-myc基因表达的研究.世界华人消化杂志，2003，11（11）:1677-1681.5 K