zhou目的蛋白质表达、纯化、检测.ppt

实验五 目的基因的原核表达及检测,现代分子生物学大实验,实验目的,重点掌握表达载体构建的原理及方法 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 掌握考马斯亮蓝染色的方法,实验原理,目的蛋白质的诱导表达 目的蛋白质的纯化 目的蛋白质的检测,实验原理,蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。 体内很难分析单个蛋白质的作用 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面,实验原理,图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白 在Hela细胞中的荧光显微镜检测（400）,例,酵母表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 表达的蛋白具有正常的活性、构象 技术难度较大、耗时、耗资,大肠杆菌表达系统 实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备 不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体,原核细胞表达系统 真核细胞表达系统,实验原理,原核细胞表达系统菌株 菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。 大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。,实验原理,原核表达质粒的构建 目的基因 表达载体,实验原理,目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer 例： p38中抑制多肽16肽序列 GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC F 5-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT-3 R 5-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-3 5端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。 3端引物中AC是随机保护碱基，G GAT CC是BamH I酶切位点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。,实验原理,表达载体 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 元件 启动子、终止子、核糖体识别序列 诱导性表达所需要的元件 操纵子序列 调控基因 多克隆位点 融合Tag 复制起始序列 筛选标记/报告基因 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。,实验原理,启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子， 转录终止子 核糖体结合位点,启动子、终止子、核糖体识别序列,操纵子序列及配套的调控基因,诱导性表达所需要的元件,多克隆位点 复制起始序列,实验原理,用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （Tag）。 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。 目前常用的标签有 组氨酸标签（His-Tag） 谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase）标签（GST-Tag） 硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）标签 麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP） 蛋白质 A（protein A） 纤维素结合位点（cellulose binding domain）标签等。 一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。,实验原理,筛选标记/报告基因表达 抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。 GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。 一些融合表达Tag也有报告基因的功能。,实验原理,常用表达载体 pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。 Ptac Promoter Amp pGEX - KG pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 T7 Kana pET - 14b,实验原理,目的蛋白质的诱导表达 lacI q（Lactose） lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。 当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。 IPTG（异丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac 操纵子的诱导剂而使用。,实验原理,实验原理,BamH I,酶切,Nde I,基因片段,酶切后的目的基因,酶切,连接,转化,筛选（蓝白斑）,鉴定（PCR、酶切、测序）,原核表达质粒的构建成功,原核表达的诱导条件 IPTG浓度： 0.01-5mmol/L 诱导时间：3h 诱导温度：15-42,实验原理,目的蛋白质的纯化 破碎细胞 超声破碎 溶菌酶裂解 从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白 GST可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。由于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白进行纯化，最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液,洗脱结合的GST融合蛋白。 Poly His多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合，因此带HIS-6的蛋白能结合与固化的Ni2+树脂，用适当的缓冲液（PBS）洗冲洗去除其他杂蛋白后，再用可溶的竞争性鳌合剂（咪唑）洗脱可以回收靶蛋白。,实验原理,目的蛋白质的检测 蛋白质分子量的检测 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 目的蛋白质的分析,实验原理,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。 SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。,实验原理,蛋白质中加入 SDS 并加热， SDS 分子上的非极性区 (黄色尾巴)会与蛋白质上的非极性区结合，使蛋白质变性，成为一线状长条分子，上面布满 SDS 分子。SDS 分子的极性区 (洋红色圆点)，则露在外面，以增加亲水性。 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异。SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子。,97.0 kDa,实验准备,诱导、培养 37恒温摇床 电泳检测 Hoefer miniVE Vertical Electrophoresis System,仪器与设备,LB培养基、Amp、IPTG 30%丙烯酰胺贮液 1.0M Tris(PH6.8)(浓缩胶),1.5M Tris(PH8.8)(分离胶) 10%SDS，10%过硫酸铵（APS作用主要是提供自由基，然后在促凝剂TEMED的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。 ），四甲基乙二铵（TEMED可以催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 ） 1XTris-甘氨酸电泳缓冲液：25mM Tris, 250mM 甘氨酸，0.1% SDS 1xSDS上样缓冲液：50mM Tris-HCl（6.8），100mM DTT，2% SDS，10% 甘油，0.1% 溴酚蓝 染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水0.5g R-250 脱色液：90甲醇：90冰乙酸：20水,实验试剂,实验步骤,培养 诱导 样品制备 SDS-PAGE 凝胶检测,实验步骤,1）挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液， 37培养过夜。 2）取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素（50ug/ml）的LB培养液，37振荡培养2h以上，至对数中期（A600=0.50.6）。 3）吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100ul PBS中，加入溶菌酶（终浓度1mg/ml）37度消化。 4）在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37 继续培养3h，取1ml样品放于微量离心管中，室温高速离心1min ，沉淀悬浮于100ul PBS中，加入溶菌酶（终浓度1mg/ml） 37度消化。 。 5）消化后混合等体积的1 x SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置，待全部样品处理完后上样。,目的蛋白质的诱导表达及检测,6 ）将电泳槽玻璃板洗净，吹干，并用凡士林封边,安装好 7 ）配12%分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽 高三分之二处，加蒸馏水密封。待胶凝固后（约需 30min倒掉 水，用吸水纸吸干 8）配5%浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内（以插入梳子不 溢出为宜），插入梳子 9）待胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中 10）制备好的样品加入上样孔 11）连接电泳仪 12）打开电源，调整电压至80V，待样品跑过浓缩胶（大约需 30min）后将电压调至120V，待指示剂（溴酚兰）到达凝胶 的底部距离下缘1cm时停止电泳，大约需2h，电泳结束。,SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶配制（mini VE）,目的蛋白质的检测-考马斯亮蓝染色,考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue）是一种三苯甲烷纺织染料，又称酸蓝83，分子上含有两个S03H基团，偏酸性，能结合在蛋白质的碱性基团上。 能够检测出大于0.1ug蛋白条带。,将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色