大鼠结肠cajal细胞库容性Ca2内流检测的临床价值.doc

大鼠结肠cajal细胞库容性Ca2+内流检测的临床价值【摘要】 目的：通过检测大鼠结肠cajal细胞中库容性Ca2+内流(capacitative Ca2+ entry，CCE)，探讨导致大鼠结肠cajal细胞内Ca2+稳态失衡的信号途径，为治疗相关疾病提供新的思路。方法：荧光探针Fura-2/AM标记细胞内游离Ca2+后，用荧光分光光度计检测乙二醇-双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)耗竭胞内钙库后对分离的大鼠结肠cajal细胞Ca2+浓度(Ca2+)的影响。结果：在无Ca2+缓冲液中加入EGTA(10 mmol/L)，细胞内Ca2+由静息时的(69.373.02) nmol/L升高至(272.525.21 ) nmol/L;继之，向细胞外液中引入1.5 mmol/L和3.0 mmol/L的氯化钙溶液，导致细胞内Ca2+进一步升高为(466.434.63) nmol/L和(977.433.27) nmol/L;且此升高效应对维拉帕米(5 mol/L)不敏感，但可被2APB(20100 mol/L)抑制。结论：酶解法并结合密度离心法分离的大鼠结肠cajal细胞上存在胞内钙库耗竭激活的Ca2+内流。这对于研究钙通道活性改变、预防和控制因胃肠动力紊乱所致的消化系统疾病具有重要意义。 【关键词】 库容性Ca2+内流结肠cajal细胞大鼠，Wistar【ABSTRACT】 Objective: To investigate the changes of capacitative Ca2+ entry(CCE) in colon cajal cells and its mechanism. Methods: Intracellular Ca2+ changes induced by EGTA -activated Ca2+ influx were measured in colon cajal cells which was freshly isolated from colon of Wistar rats with acute enzymatic dissociation and ficoll density centrifugation method.with the fluorescent indicator Fura-2/AM. Results: In the absence of external Ca2+, the concentration of calcium-chelating agent EGTA elevated Ca2+ from (69.373.02)nmol/L to (272.525.21)nmol/L,a subsequent reintroduction of Ca2+ into the extracellular solution resulted in further Ca2+ elevating to 466.434.63)nmol/L and(977.433.27)nmol/L respectively, and the response was blocked by 2APB, but it was insensitive to L-type voltage calcium channels blocker verapamil. Conclusion: Ca2+ influx activated by store depletion are present in colon cajal cells, it has the value for further study on gastric motility disorder diseases.【KEY WORDS】 Capacitative Ca2+ entry Colon cajal Wistar rats钙离子(Ca2+)是细胞间连接和信号传递的重要成分，影响细胞重要的生理功能。钙离子浓度(Ca2+)变化对胃肠平滑肌的收缩与舒张起着决定性作用。因此，Ca2+与胃肠动力紊乱疾病的关系引起人们越来越多的关注，成为近年研究的靶点。本研究通过检测大鼠结肠cajal细胞Ca2+内流，探讨导致大鼠结肠cajal细胞内Ca2+稳态失衡的信号途径，为治疗因胃肠动力紊乱所致的消化系统疾病提供新的思路和实验依据。1材料与方法1.1溶液与配制胶原酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、牛磺酸、二甲基亚砜(DMSO)、Fura-2/AM、Triton X-100、锥虫蓝、维拉帕米以及牛血清白蛋白均购于Sigma公司。HEPES-Ringer缓冲液成分：氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，氯化钙1.5 mmol/L，溶液pH值以氢氧化钠5 mol/L调至7.0。无钙缓冲液成分：氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，EGTA 0.2 mmol/L。含酶细胞分离液用低钙缓冲液：氯化钙0.03 mmol/L ，氯化钠126 mmol/L，氯化钾6 mmol/L，HEPES 6 mmol/L，D-葡萄糖11 mmol/L，氯化镁1.2 mmol/L，EGTA 0.2 mmol/L。Fura-2/AM以DMSO溶解，DMSO终浓度<0.1%。1.2大鼠结肠cajal细胞的分离体质量200250 g成年Wistar大鼠，雌雄不限。采用酶解法并结合密度离心法1分离结肠cajal细胞。分离出的细胞以孔径500 m的尼龙网过筛，悬浮于无钙缓冲液中。取1滴细胞悬液做锥虫蓝排斥试验，证明细胞成活率在90%以上。1.3实验分组将分离好的大鼠结肠cajal细胞随机分为4组，做不同处理。1)对照组：在无钙HEPES-Ringer缓冲液中测大鼠结肠cajal细胞静息Ca2+，随后向细胞悬液中分别引入1.5 nmol/L和3.0 nmol/L的氯化钙溶液测定Ca2+。2)EGTA组：操作前先给予10 mmol/L EGTA，其他处理与对照组相同。3)EGTA+维拉帕米组：操作前先给予10 mmol/L EGTA和5 mol/L维拉帕米，其他处理与对照组相同。4)EGTA+2APB组：操作前先给予10 mmol/L EGTA和2APB(20、40、60、80和100 mol/L)，其他处理与对照组相同。1.4Fura-2/AM负载细胞及荧光测定Ca2+将上述4组细胞悬液置于透明容器中，向细胞悬液中加入溶于DMSO的终浓度为5 mol/L的 Fura-2/AM溶液，37 恒温孵育30 min，常温1 500 r/min离心1 min，冲洗2次，用无钙缓冲液悬浮，在倒置显微镜下调整细胞数至109 L-1。用960 MC荧光分光光度计测定Ca2+，激发波长为340 nm和380 nm，激发波长变换时间2 s，发射波长500 nm。记录4组大鼠结肠cajal细胞给药前后荧光强度F340/F380的比值。依据Grynkiewicz公式计算Ca2+。Ca2+=Kd(R-Rmin)/Rmax-R) b，其中Kd=224 nmol/L，为Fura-2与Ca2+的反应解离常数;R=F340/F380，为不同条件下的荧光强度值。Rmax为最大荧光强度，即加入Triton X-100(终浓度0.1%)后测得的荧光强度值;Rmin为最小荧光强度，即在Rmax基础上加入EGTA(终浓度5 nmol/L)测得的荧光强度值;b=F380 Rmax /F340 Rmin;在没有负载Fura-2/AM时测定细胞自身荧光，计算Ca2+时应减去细胞自身荧光。所有测定在40 min在完成。每组测定3次，取平均值。1.5统计学处理实验结果以xs表示，应用SPSS10.0软件进行统计学分析，使用配对资料的t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1不同处理因素对大鼠结肠cajal细胞游离Ca2+的影响在无钙HEPES-Ringer缓冲液，大鼠结肠cajal细胞静息Ca2+为(69.373.02) nmol/L，向细胞悬液中分别引入1.5 nmol/L和3.0 nmol/L的氯化钙溶液，此时静息Ca2+为(123.466.35)、(184.433.08)nmol/L，而EGTA组大鼠结肠cajal细胞Ca2+显著提高，差异有统计学意义(t=4.12，P<0.05,表1)。与EGTA组相比，EGTA+维拉帕米组诱导的胞外Ca2+内流变化无统计学意义(t=2.56，P>0.05，见表1)。2.2不同剂量2APB对胞外Ca2+内流的影响预先给予不同剂量2APB处理后，胞外Ca2+内流均发生显著变化(t=6.72，P<0.01)，且抑制率随2APB浓度的提高而增加(图1)。3讨论近年结肠动力紊乱所致的消化道疾病越来越引起人们的关注。引起胃肠平滑肌自动节律性运动的起搏细胞是位于纵行肌和环行肌之间的cajal间质细胞， 这是一种兼有成纤维细胞和平滑肌细胞特性的间质细胞，能够发动平滑肌的慢波， 控制胃肠平滑肌的节律性运动2。而胞内Ca2+的变化在cajal间质细胞产生起搏电流的过程起着重要的作用。胞内Ca2+来源于钙库释放和细胞外Ca2+内流。Ca2+内流具体过程是，钙池中Ca2+释放导致内质网上IP3受体的构象改变，IP3作用于内质网(endoplasmic reticulum， ER)或肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)，引起钙库释放Ca2+。当钙库耗竭，诱发细胞膜上钙池操纵Ca2+通道(store-operated Ca2+ channels， SOC)开放而促进胞外Ca2+内流，钙库重新充盈，这种Ca2+内流的方式称为库容性Ca2+内流(capacitative calcium entry，CCE)3。其开放与关闭完全由细胞内钙贮库内质网、肌浆网及线粒体中的Ca2+储备来调控。目前研究发现，CCE的作用不仅是充盈耗竭的胞内钙库，且作为收缩的激活信号Ca2+的来源4。EGTA是Ca2+的快速螯合剂，具有螯合胞质中的游离Ca2+的作用。本研究采用EGTA耗竭细胞内钙库，并在EGTA存在下，向细胞悬液中分别引入不同浓度的Ca2+，引起细胞内Ca2+明显升高，该效应不被L型电压操纵性钙通道阻滞剂维拉帕米所抑制5。表明在大鼠结肠cajal细胞上存在胞内钙库耗竭后激活的胞外Ca2+内流。本研究还发现EGTA诱发的Ca2+内流可以被20100 mol/L的2APB所抑制。文献报道， 2APB可能是一种SOC和瞬时受体电位 (transient receptor potential，TRP)通道抑制剂，其抑制率随2APB浓度的提高而增加6-7。由于SOC是细胞外游离Ca2+进入大鼠结肠cajal细胞内的重要通道，因而推测2APB通过抑制大鼠结肠cajal细胞的SOC来影响大鼠结肠cajal细胞内的Ca2+平衡。总之，细胞内Ca2+作为第二信使，在复杂的生命活动中发挥重要调节作用， 细胞内Ca2+稳态失衡与cajal细胞生理学功能的研究对揭示胃肠动力性疾病的发病机制具有重要意义。【参考文献】 1 李春穴，童卫东，刘宝华，等.Cajal 间质细胞的分离、培养方法探讨J.消化外科，2004，3(4)：267-269.2 林琳，许海尘，张红杰，等.结肠慢传输运动小鼠Cajal间质细胞的改变J.世界华人消化杂志， 2004，12(9):2107-2110.3 周华，宋洁，胡金兰，等.滑肌细胞上钙库操纵性通道J.生理科学进展，2005，36(4): 369-371.4 孔德虎，周华，宋洁，等.库容性Ca2+内流参与ACh诱导的大鼠远端结肠平滑肌收缩J.生理学报，2006，58(2):149-156.5 柯道平;周华;李忠稳;等.库容性Ca2+内流介导大鼠远端结肠平滑