蛋白质的功能与进化-教学用.ppt

第 6 章,蛋白质的功能 与进化,一、蛋白质功能的多样性(自学) 二、血红蛋白的结构 三、血红蛋白的功能：转运氧 四、血红蛋白分子病 五、免疫球蛋白 六、氨基酸序列与生物学功能,教学内容,二、血红蛋白的结构,光合作用大气变化氧气不断增加生物进化到以氧为基础的代谢。 进化中出现了两种重要的氧结合蛋白：肌红蛋白、血红蛋白 肌红蛋白适合氧的贮存、血红蛋白适合氧的运输,(一) 血红素 (二) 珠蛋白的三级结构 (三) 与O2结合的机制 (四) 血红蛋白的四级结构,二、血红蛋白的结构,肌红蛋白和血红蛋白的辅基,(一)血红素,血红素，原卟啉与还原型Fe2+的络合物,(二)珠蛋白的三级结构,肌红蛋白（Mb）： 单体蛋白, 一条多肽链和一个血红素辅基构成, Mr 17 000, 153个氨基酸残基。Mb的脱辅基蛋白质称为珠蛋白（globin）。 Mb主链：8个螺旋区段， 分别命名为A、B、CH；相应的非螺旋区段(也称拐弯)为NA(N-末端区段)、AB、BCFG、GH、HC （C-末端区段）。 氨基酸残基两种表示法： His F8, 即从N端开始His93,(二)珠蛋白的三级结构,血红素结合部位除内衬一层疏水残基外，还有两个 His 残基，His E7 和 His F8， 它们在氧结合中起关键的作用。,(二)珠蛋白的三级结构,His F8, 为近端组氨酸，其咪唑N成为血红素Fe()的第5配体。当肌红蛋白与氧结合变成氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）时, Fe()的第6 配位被O2占据。,(二)珠蛋白的三级结构,His E7,为远端组氨醯(distal His)，在血红素基与氧结合的一侧,离血红素稍远，不与Fe()成键，与O2分子紧密接触，使O2轴不能垂直于环平面，约有60的倾斜，因此氧结合部位是一个空间位阻区域。,(三)与O2结合的机制,水中游离的血红素也能与氧结合，但血红素Fe()被氧化成高铁血红素Fe()。 肌红蛋白的疏水空穴中，可以避免与水接触，使血红素Fe()不易被氧化。当与O2结合时发生暂时性电子重排，去氧后铁仍处于亚铁态。 血红素-血红素作用增强Fe()的氧化, 珠蛋白氧结合部位的空间位阻使两个血红素基团不能靠足够近, 不易发生这种相互作用。,空间位阻也降低血红素对CO的亲和力，游离的血红素结合CO比结合O2的能力强25 000倍，而珠蛋白中血红素对CO的亲和力仅为对O2的250倍。肌红蛋白和血红蛋白凭借位阻降低了对CO的亲和力，有效地防止代谢过程中产生的少量CO的毒害。 空气中CO含量达0.06%0.08% 即有中毒危险,达0.1% 则使人窒息死亡。,2个亚基和2个亚基杂四聚体, 近球形(6.4 nm 5.55.0nm)，也可看成由两个原聚体()构成的对称二聚体。,(四)血红蛋白(Hb)的四级结构,去血红素的亚基和亚基也属于珠蛋白家族，-珠蛋白(141个残基)和珠强白(146个残基)。 Hb含4个血红素，能结合4个O2。Hb中作为氧结合部位的空穴与Mb中的极相似, 它们都有两个关键的His残基(E7和F8)和两个疏水残基(Phe CDl和Leu F4)。,(四)血红蛋白(Hb)的四级结构,和Mb一样，Hb上的氧结合部位也能可逆地与O2结合而不使Fe()氧化，并且也降低了血红素与CO的亲和力。 Hb的四级结构带来Mb没有的两个结构特点：,(四)血红蛋白(Hb)的四级结构,2,亚基缔合出现一个中央空穴，为 BPG 结合部位。,特点一：,特点二：,出现亚基之间相互作用区域，特别是和之间的接触界面。 和接触有两种： Hb半分子（11和 22）中和的接触为装配接触； 半分子之间的和接触（1和2、 2和1） ，滑动接触,一、蛋白质功能的多样性(自学) 二、血红蛋白的结构 三、血红蛋白的功能：转运氧 四、血红蛋白分子病 五、免疫球蛋白 六、氨基酸序列与生物学功能,教学内容,(一) 肌红蛋白是氧的贮库 (二) 血红蛋白氧合的协同性和别构效应 (三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态 (四) 血红蛋白协同性氧结合的定量分析 (五) BPG调节Hb对O2的亲和力 (六) H和CO2调节Hb对O2的亲和力：Bohr效应,三、血红蛋白的功能：转运氧,(一) 肌红蛋白是氧的贮库,Mb与O2结合的化学计量关系：,氧解离平衡常数：,MbO2 与 Mb 之比 与O2成正比,或,(一) 肌红蛋白是氧的贮库,氧分数饱和度Y,或,根据Henry定律，溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该气体分压成正比：,另一种表达Mb与O2的结合的化学计量关系：,P(O2)：可被调节和测量，单位kPa（1kPa=7.5torr 或mmHg） Y：分光光度法测量,氧结合曲线或氧解离曲线,当 Y = 1 时，饱和 当 Y = 0.5 时, p(O2) = K = P50 或 P0.5 P50的定义：肌红蛋白被氧半饱和时的氧分压,用氧分压和氧分数饱和度作图：Mb 的氧结合曲线是一等轴双曲线,氧结合曲线或氧解离曲线,Mb的P50为0.27kPa 肌肉毛细血管中氧浓度约为3kPa ； 细胞内表面约为1.33kPa （Mb80%被饱和）； 线粒体中为01.33kPa （Mb25%被饱和）；,结论：大多数情况，Mb是高度氧合的，氧的贮存库，有利于细胞内的O2从质膜向线粒体运转,Hb，四聚体，通过亚基-亚基相互作用调节它的氧合能力引出别构效应概念 别构效应(allosteric effect)：又称为变构效应。多亚基蛋白质一般有多个配体结合部位。一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称别构效应。具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白质, 如血红蛋白。 别构（或变构），原指蛋白质分子不止含有正常配体结合部位(如活性部位)，尚有别的配体如调节物或效应物结合部位调节部位或别构部位。别构蛋白质的调节物可以是激活剂或抑制剂。,（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应,别构效应：有同促别够效应和异促别够效应两种情形 同促别构效应：调节物和正常配体是同一种分子，发生相互作用的部位是同种的，一个配体的结合影响同种配体与其余同种空位的结合能力，一般使亲和力加强具有协同性或正协同性。 正协同同促效应表现为S形配体结合曲线，正协同结合使蛋白质对配体浓度的应答更为敏感。负协同同促效应，它不呈现S形曲线。,（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应,异促效应：调节物是正常配体以外的分子， 发生作用的部位不是同种的，即正常配体的结合行为受到另一种配体(调节物)与另一种部位(别构部位)结合的影响。 血红蛋白有正常配体结合部位和调节物结合部位, 既有同促效应又有异促效应。O2 可被认为是Hb的正常配体又是同促调节物，BPG是异促调节物。,（二）血红蛋白氧合的协同性和别构效应,(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态,Hb有两种可结合氧的互变的构象状态，T态、R态。 T态，去氧Hb主要构象； R态，氧合Hb主要构象。,(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态,8个盐桥 Both - and -subunits have Tyr as the penultimate C-terminal residue (Tyr 140 Tyr HC2; Tyr 145 Tyr HC2，respectively)。酪氨酸-OH 与 Val FG5 (Val FG5 is 93 and98，respectively) 形成氢键；,缺氧时 T 态的被稳定：,(三) 血红蛋白的两种构象状态：R态和T态,The shift in helix F upon oxygenation leads to rupture of this Tyr HC2:Val FG5 hydrogen bond. Further, eight salt bridges linking the polypeptide chains are broken as hemoglobin goes from the deoxy to the oxy form Hb半分的彼此滑动、旋转，使亚基之间的空穴变窄，致使BPG，进入R状态，O2被结合,有氧时，O2与T态 Hb 结合：,1910，Hill A 对血红蛋白与O2的协同性结合作过定量分析。 暂设O2与Bb的结合是一种“全或无”的现象。,(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析,则解离平衡常数:,Hb的氧分数饱和度： 或,两边取负对数：,Hill方程,对 作图，Hill作图,根据方程，Hill图应有个 n 的斜率。 但测得的斜率反映的不是氧结合部位的数目， 而是部位之间相互作用的程度。 故Hill图的斜率用nH 表示，即Hill系数，是协同程度的量度。,(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析,若 n =1， 配体结合非协同， 如肌红蛋白。 若nH1，正协同， 血红蛋白。 若nH = n，即nH达到理论极限， 配体结合完全协同。但实测 nH 总小于蛋白质中的配体结合部位数。 若nH1，负协同，也即一个配体的结合导致后续配体更难结合， 但例子很少。,(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析,Hb 的 nH2.8，在 nH 1和 nH 4 两极端之间，表明 Hb 和 O2 的结合是高度协同的，但不完全协同， 因n个O2在一瞬间结合到同一 Hb 分子的概率几乎等于零.,(四)血红蛋白协同性氧结合的定量分析,第一个亚基和氧结合情况,第四个亚基和氧结合情况,Hb：肺泡中 Y = 0.97， 肌肉毛细血管中Y = 0.25。释放的氧的 Y = 0.72。 Y : 血红蛋白输氧效率的指标。协同性将增加Y值。 如果是肌红蛋白：从肺泡输氧到肌肉，虽然p(O2)有相的改变，但Y 不到 0.1，表明Mb不适合于担当从肺部到组织转运氧的角色.,肺泡中的p(O2)约为13 kPa；肌肉毛细血管中p(O2)约3 kPa。,Hb适合运输氧的原因：,(五) BPG调节Hb对O2的亲和力,BPG，Hb 的负异促效应物或称别构抑制剂。 BPG与Hb 作用是异促别构调节的实例。 正常红细胞约含 4.5 mmol/L BPG，和Hb等摩尔数，BPG 部位在亚基形成的中央孔穴。 高负电荷BPG把两链交联在一起。 Hb 分离提取后，仍结合相当量的BPG，很难完全被除去。,(五) BPG调节Hb对O2的亲和力,BPG和链之间的离子键有助于稳定T态的Hb构象，促进氧的释放。 变为R态时，Hb中央孔穴变小, 容纳不了BPG， 因O2的结合引起Hb构象变化，扰乱了BPG的结合部位。 O2和BPG与Hb的结合互相排斥。 BPG：肌肉组织代谢产生。,完全脱BPG的 Hb对O2的亲和力很高， 能在4kPa p(O2)下为O2所饱和，几乎不释放氧，氧结合曲线呈双曲线形式。,BPG对Hb 样合曲线的影响,肺部p(O2)大于13 kPa，Hb几乎全被O2饱和，BPG与氧合关系不大。外周组织p(O2)低(4 kPa)，如无BPG，就会减少Hb对组织的氧供应。有BPG (4.5mmol/L)的存在，Hb对O2的亲和力低，氧结合曲线呈现正常的S形曲线，供给组织的氧量(卸氧量)约为血液所能携带的最大氧量的40%(Y)。,BPG对Hb 样合曲线的影响,常人在短时间内由海平面升到海拔4 500 m高山时，红细胞中的BPG浓度几小时后就开始上升，两天内可由4.5mmol/L 增到 7.5mmol/L. 释氧从30%提高约40%,BPG对Hb 样合曲线的影响,CO2和H+组织呼吸产生的两个终产物。 CO2水中的溶解度很小，容易形成气泡。红细胞含丰富的碳酸酐酶，催化CO2和水生成HCO3- 和 H+。 呼吸产生的CO2 约70%80%以HCO3-的形式转运到肺部. CO2 水合增加了组织中的H+浓度。 CO2也能和 Hb 氨基末端 -NH2共价结合生成氨基甲酸Hb (Hb-NHCOO-), 约20% CO2以此形式转运到肺部；同时也产生H+，进一步降低组织中pH。 Hb与O2结合和与H+(或CO2)结合是相拮抗的. H+ 将提高O2 释放。,(六) H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应,(六) H+和CO2调节Hb对O2的亲和力:Bohr效应,Bohr 效应：当H+浓度增加时，Hb氧分数饱和度曲线右移。pH 对 Hb 氧亲和力的影响，因丹麦生理学家Bohr G发现而得名。,pH对Hb氧分数饱和度曲线的影响： 肺中血液pH7.6，组织中pH7.2， 氧结合实验常在pH7.4 下进行,血液流经组织时，这里的pH较低，CO2较高，使组织能比单纯p(O2)降低获得更多的氧，而氧的释放又促使Hb与H+和CO2的结合，以补偿由于组织呼吸引起的pH降低，起着缓冲血液pH的作用。 血液流经肺部时, 这里p(O2)高，有利于血红蛋白与氧的结合，促进H+和CO2的释放，同时CO2呼出又有利于氧合Hb的生成。,Bohr 效应的生理意义：,(一) 镰状细胞贫血病 (二) -和-地中海贫血,四、血红蛋白分子病,血红蛋白病(hemoglobinopathy)，或链发生了变化，例如镰状细胞贫血病等； 地中海贫血(thalassemia)，缺少了或链，例如-和-地中海贫血病。,Hb分子病可分为两类：,(一) 镰状细胞贫血病,非洲的某些地区发病率非常高。Hb量仅为正常人(1516g/100 mL)的一半，红细胞数目也是正常人的一半左右.,Val侧链： “粘性” 突起与 Phe 85、Leu 88形成的互补口袋借疏水作用形成纤维状结晶，使红细胞弯成镰刀状，不易通过毛细血管，因而血流变慢，导致组织缺血受伤，影响器官正常功能,镰状细胞贫血病发病机制：,缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因; 所有基因都可能存在,但一个或多个基因发生无义突变,结果产生缩短了的蛋白链,或发生移码突变,致使合成的链含不正确的氨基酸序列; 所有基因都可能存在,但突变发生在编码区之外,导致转录被阻断或前体mRNA的不正确加工。,(二) -和-地中海贫血,产生途径:,(二) -和-地中海贫血,-地中海贫血： -珠蛋白基因丢失或不能表达，此缺损的纯合子个体将产生严重的症状。患者不能制造链，必须依赖胎链的继续产生以形成有功能的血红蛋白(Hb F)。 链的产生可以继续到童年，但多数不到成熟就夭折了. 杂合子患者症状较轻，这种人有一个基因仍是正常的，-地中海贫血性状。,(二) -和-地中海贫血,-地中海贫血: 在每个染色体上有两个邻接的拷贝(1和2)，它们的蛋白质产物只差一个氨基酸残基，并且都是有功能的，因此一个人可以有4、3、2、1或0个基因拷贝。 含4个拷贝是正常的，仅含1个拷贝的可能表现出轻微的症状，即-地中悔贫血性状。 0个拷贝则是致命性的，称为-地中海贫血。-珠蛋白链的水平低下时，将形成同四聚体: 4或 4等。同四聚体能结合O2，但无协同性或无别构效应，因此不能发挥正常的功能。,(一) 免疫系统(自学) (二) 免疫球蛋白的结构和类别 (三) 基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法,五、免疫球蛋白,(一) 免疫系统(自学),The table summarizes the functions of the various leukocytes of the immune system,体液免疫 细胞免疫 抗原 抗体 抗原决定簇（表位）,Molecules of Mr5,000 are generally not antigenic,(二) 免疫球蛋白的结构和类别,免疫球蛋白(抗体), 可溶性血清糖蛋白，血清中最丰富的蛋白质之一。 抗体具有两个显著的特点：高度的特异性; 庞大的多样性。,特异性：一种特定的抗体只能与引起它产生的相应抗原发生反应。 多样性：抗体可以和成千上万种抗原(天然的和人工的)起反应。,Y形结构；4条链：二重、二轻。 抗体分子 (IgG) 二价；抗原分子可以是多价的。 价数：抗原与抗体结合部位数目。 当抗体和抗原接近等物质的量(称为等价带)浓度时，将发生最大的交联，产生最大量的免疫沉淀或沉淀素 体外沉淀反应广泛用于研究抗原-抗体反应，实验免疫学的基础。,免疫球蛋白的结构,免疫球蛋白的类别,Each class has a characteristic type of heavy chain, denoted 、 and for IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, respectively；Two types of light chain,and,occur in all classes of immunoglobulins.,Ig G 记忆B细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，可以通过胎盘。 Ig A 唾液、泪液、乳汁等分泌物的主要抗体，可单体、二聚体或三聚体。 Ig M 初次免疫反应早期产生的，可以以单体形式与膜结合，或形成5聚体。 Ig D 主要存在于B细胞表面，功能不详。 Ig E 与过敏源结合诱导细胞产生组胺和其他活性胺，使血管扩张，渗透性增大，引起炎症反应。,免疫球蛋白的类别,Ig M,(三) 基于抗体一抗原相互作用的生化分析方法,Polyclonal antibodies are those produced by many different B lymphocytes responding to one antigen, such as a protein injected into an animal. Cells in the population of B lymphocytes produce antibodies that bind specific, different epitopes within the antigen. Thus, polyclonal preparations contain a mixture of antibodies that recognize different parts of the protein. Monoclonal antibodies, in contrast, are synthesized by a population of identical B cells (a clone) grown in cell culture. These antibodies are homogeneous, all recognizing the same epitope.,单克隆抗体的制备,用选定的抗原免疫小鼠，取出脾脏，制备B淋巴细胞。 培养小鼠的骨髓瘤细胞。 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。 转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上,培养选择杂交瘤细胞。 用ELISA筛选产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 用小鼠腹水或培养箱培养选出的杂交瘤细胞。 纯化所需的单克隆抗体。,酶联免疫吸附测定,Coat surface with sample (antigens). 如 HIV Block unoccupied sites with nonspecific protein. 如酪蛋白或牛血清白蛋白 Incubate with primary antibody against specific antigen. 如抗HIV外壳蛋白的兔I G Incubate with antibody-enzyme complex that binds primary antibody. 如辣根过氧化物酶标羊抗兔的抗抗体,即羊抗兔IgG或第二抗体 Add substrate. 如辣根故氧化物酶，加 3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺 Formation of colored product indicates presence of specific antigen. 如是四甲基联苯胺则产物黄色，450nm有最大光吸收，量与待测抗原或抗体量成正比,也称Western印迹， 操作上类似用于核酸分析的Southern印迹。 对蛋白质样品进行凝胶电泳分离,然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起，进行转移,将凝胶上的蛋白条带转印到