微生物限度检查法增修订内容.ppt

中国药典2005版微生物限度 检查法增修定内容 苏德模,中国药典2005版微生物限度检查法在检查项目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。 增订中主要的有四项：一是三菌数测定的方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。 前言 增订 微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法现行标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。,培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录 XVII ）的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。 (培养基配制、灭菌、质量与使用) 培养温度 细菌和控制菌的培养温度未改动。霉菌和酵母菌的培养温度20-25 改为 23-28。 抽样量和检验量虽分别单列，但突出的是检验量。 以检验量为标题，抽样量列在检验量叙述完了之后。 即一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）的3倍量。 检验量 指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量增加10g或10ml。,培养基、试药、试液、指示液、稀释剂的配制和微生物限度标准均编排在检查法后。英美药典将培养基、稀释剂放在供试液制备之前。 供试液的制备 用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养基。 7类供试品供试液的制备，其中非水溶性供试品 供试品5g，司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80 供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加45100ml pH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，水层过滤，贴膜培养。,非水溶性膜剂供试品 二部未变动，化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液(1:1)。一部中药膜剂取50 cm2，剪碎，适量的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（50或100ml）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP2000版规定:中药膜剂取30-50cm2 ，剪碎，加水100ml）。 肠溶及结肠溶制剂 供试品10g，加100ml pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）,于45水浴振摇，使溶解。,气雾剂、喷雾剂供试品 取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温，并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成110的供试液。,具抑菌活性的供试品 当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有： 培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级2ml供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操作，培养、计数。每1ml供试液所注各平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍数的值按菌数报告规则报告菌数。 控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。,离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，3000转/分离心20min（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。 薄膜过滤法 采用开放式薄膜过滤器。 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。,细菌、霉菌及酵母菌计数 增订 计数方法的验证 对药品进行微生物限度检查法时，首先应进 行检测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌 计数方法的验证，以确认该计数方法是否科 学、准确、客观（产品质量）。若供试品的 组分或原检验 条件发生改变可能影响检验 结果时，计数方 法应重新验证。验证时，按供试液的制备， 细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下 列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进 行验证。,验证用菌株及菌液的制备 菌株（代表性） 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉菌。 菌液制备（菌种传代、保存及使用5代） 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50100cfu的菌液。 （黑曲霉菌液制备、比浊法计数）,验证方法 试验组 取规定量最低稀释级的供试液1ml，和50100cfu试验菌，每株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。 菌液组 测定加入的试验菌液的菌数。 供试品对照组 取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。 稀释剂对照组 取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml 供试液含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。,试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 100% 稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）100% 结果判断 在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。 验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 (报批、送检的样品，必须附上方法验证材料),2.检查法 （1）平皿法 增订 阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得长菌。 修订 细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般48h，真菌72h；必要时，可适当延长培养时间5-7天。（细菌培养时间USP48-72h，Ep5天；真菌培养时间USP 5-7天，EP5天。平皿法；BP平皿法和涂抹法） 定量菌液滴种平皿法。影响计数的因素： 在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。,菌数报告规则 修订。 删去：高低两稀释级菌落数比值2，以两稀释级的均值报告；3个稀释级的平均菌落数均在30300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘稀释倍数报告；各稀释级均在300(100)以上，按最高稀释级平均菌落数乘稀释倍数报告。改写为4条规定。简明，格式、条理清楚。 细菌数30300，霉菌数30100。 当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。,当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,（2）薄膜过滤法 增订 滤膜孔径直径、材质、过滤等相关的要求。 取相当于1g或1ml供试品的供试液，加至100ml稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。,阴性对照试验 取试验用的稀释剂2ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。目的：检验稀释剂或冲洗液、吸管、滤器、培养基、环境和操作技术是否符合无菌性要求。 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100个。 菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若最低稀释级的滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（1g或1ml供试品/滤膜），或以1乘以稀释倍数的值报告菌数。 （涂抹法、滴种平皿法和试管法）,控制菌检查 增订 1.控制菌检查方法的验证 对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，检查法法应重新验证。 验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。,菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。 菌液制备 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养18-24h，取培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。 验证方法 试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。,阴性菌对照组：设立阴性菌对照组的目的是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。 结果判定 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。,2.检查法 供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检查，增菌培养基的实际用量同“方法的验证”。 阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 阴性对照试验 取稀释剂10 ml加入100 ml（或200 ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。,控制菌检查的步骤： 取供试液接种增菌培养基，增菌、分离培养，革兰染色、生化试验等基本未变动，仅一些控制菌保留了前几项主要生化鉴别试验，删去了一些生化鉴别方法，这样的删节、简写，主要是节省篇幅。并不是删去，可以不做。如有可疑菌落，应进行分离、纯化、革兰染色镜检和适宜的生化试验，确认是否是要检查的控制菌。,大肠埃希菌 取供试液10ml直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，培养1824小时，必要时可延至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。,如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。（ChP、BP、USP）,沙门菌 修订 取供试品10g或10ml加至200ml的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验组。取10ml稀释液加至200ml营养肉汤培养基中，为阴性对照组。培养18-24h，阴性对照应无菌生长。 取上述培养物1ml，接种四硫磺酸钠亮绿培养基，培养后，划线分离胆盐硫乳琼脂（或SS）或MacC(或EMB)培养基平板，培养1824小时（必要时延长至4048小时）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出沙门菌。,若平板上生长的菌落特征与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选23个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养1824小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。（ChP、BP、USP预增菌时间）,铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基增菌，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养1824小时。特征性菌落，纯培养，革兰染色，镜检及氧化酶试验，绿脓菌素试验。 若疑似菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试。 若氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基培养1824小时，必要时可延至48小时的培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养2472小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选23个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养1824 小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养1824小时，作血浆凝固酶试验。,增订 大肠菌群和梭菌检查法。 大肠菌群（Coliform 或Coliform bacteria）作为水质粪便污染的指示菌已有80多年的历史。大肠菌群是指在37生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。大肠菌群基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量。,大肠菌群分类,国际上用大肠菌群作为卫生指示菌，有三种不同体系： 1.肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的4类细菌，只有大肠埃希菌才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。直接检查 E.coli，一步到位，印度。64年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。 2.检查大肠菌群 乳糖发酵的4类菌，其卫生学意义是相同的，都是来自人和动物的粪便污染，检查大肠菌群即可。WHO 50年来一贯的方法，在大多数国家推行。为了与国际接轨，我国食品卫生74年开始采用国际通用的大肠菌群检查法。 3.只要是发酵型的细菌，便可认为是大肠菌群。采用葡萄糖发酵试验检测，包括了肠杆菌科所有的细菌。前苏联20世纪50年代引入我国，一直沿用到20世纪60年代初期。,大肠菌群检查方法 1.我国食品卫生国标方法 初发酵 3管或5管胆盐乳糖培养基，产酸产气；EMB分离培养； 复发酵 挑选多个可疑菌落，复发酵确证，报告MPN。 2.WHO 假定试验 MacC肉汤或乳糖胰动肉汤，产气假定阳性；不产气，再培养24h，产气，假定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。 证实试验 阳性管接种煌绿乳糖胆盐肉汤2管，1管3748h，产气，报告检出大肠菌群。1管4424h，产气，报告检出耐热大肠菌群,大肠菌群的检查方法是成熟的，在食品大肠菌群检查中已广泛使用。但药品不同于食品，有些药品有抑菌作用，因此在药品中检查大肠菌群，必须采用适当的方法对供试品进行处理，消除其抑菌作用后方可检查。同时从方法学的可信度考虑，应设阳性对照和阴性对照。因此，推荐的大肠菌群检查法是经过大量考察验证、准确可靠、简便易行的方法。 初步考察结果表明，大肠菌群的检出率远高于大肠埃希菌，粪大肠菌群的检出率为零。不难看出，以大肠菌群作为口服药品的控制菌较为合理，更具实际意义。,取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1：10供试液1ml(供试品量0.1g或0.1ml)，1：100供试液1ml(供试品0.01g或0.01ml)，1：1000供试液1ml(供试品0.001g或0.001ml)。另取1支乳糖胆盐发酵管，加1ml稀释剂，作阴性对照。各管置361培养18-24h，阴性对照应无菌生长。 乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气（或产酸不产气），报告供试品未检出大肠菌群；如有产酸产气者，应将产酸产气的发酵管分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上，培养1824h，。如平板上无菌落生长，或有菌落生长但不发酵乳糖、非革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，判该管未检出大肠菌群；如平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，为革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，应做确证试验。,确证试验 取上述平板上的可疑菌落45个，各接种1支乳糖发酵管，培养2448h。凡产酸产气、革兰阴性无芽孢杆菌判该管检出大肠菌群。反之，判该管未检出大肠菌群。 根椐检出大肠菌群的管数，按表3报告供试品每1g或1ml的大肠菌群数。 （食品卫生确证试验取12个菌落接种乳糖发酵管。混合菌培养。),梭菌（Clostridium） 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接至100ml的0.1%新鲜庖肉培养基中。阴性对照加入的稀释剂为10ml。各培养基管在厌氧条件下培养7296小时。如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2 ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养4872小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选23个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。,过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。 若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。 （ BP：样品2份，1份加热、1份不加热，厌氧培养7296h，0.2ml加至含庆大霉素哥伦比亚琼脂平板，厌氧培养4872h，划线不含庆大霉素哥伦比亚琼脂平板，有氧、厌氧培养48h，如在厌氧生长有菌，作过氧化氢酶试验。）,结果判断 原规定5条，删去了1条。这4条的先后顺序做了调整，突出重点。 供试品若检出控制菌或其他致病菌，按一次检出为准，不再抽样复试。 3种菌数任一项不合格，应从同一批样品中随机抽样，复试2次，以3次结果均值报告。 眼科用药的霉菌和酵母菌菌数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品不合格。 3种菌数和控制菌任一项不合格，判该供试品不符合规定。 删去了在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数判断结果。,培