浙江大学生物化学实验甲不同植物SOD提取及活力测定.ppt

不同植物SOD提取及活力测定,1、SOD简介 超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于动、植物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下： 生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能力降低的情况，并由此引发一系列疾病。如脂质的过氧化与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、辐射损伤、高度中毒等。,不同植物SOD提取及活力测定,SOD由于可以清除氧自由基，因此可以防止这些疾病的产生。而且，SOD还可作为一种添加剂，添加到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由基增多而引起的一系列疾病和延缓衰老方面起到一定作用。 2、活性测定原理 SOD活性测定的方法很多，常见的有化学法，免疫法和等电聚焦三种，其中以化学法应用最普遍。,不同植物SOD提取及活力测定,本试验即采用化学法来测定SOD的活性，使用的试剂为氮蓝四唑（NBT），NBT在光照下能与O2发生光化还原反应生成蓝色甲潛（qian），该化合物在560nm处具特征光吸收，而SOD能抑制NBT的光化还原，有关的化学反应式如下：,不同植物SOD提取及活力测定,不同植物SOD提取及活力测定,3、试验步骤 各步试验步骤及注意事项解说祥见p118。 4、实验结果及处理 SOD活性计算公式：,（二）SOD同工酶活性染色,1、SOD同工酶简介 在高等生物的组织和器官中普遍存在着SOD同工酶，按其结合的金属离子的不同可分为：Fe-SOD，Mn-SOD，Cu、Zn-SOD三种，这三种酶均能催化氧自由基的清除反应。 Fe-SOD，Mn-SOD在蛋白质一级结构、空间结构、分子量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感性等方面与Cu、Zn-SOD差别较大。,（二）SOD同工酶活性染色,Mn-SOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体。 Fe-SOD大多数为二聚体。 这两种SOD的许多性质都很相似，如两种酶的一级结构和空间结构均很相似，每个亚基的分子量一般均为23000D，并含有0510个Mn或Fe原子。不同来源的Fe-SOD和Mn-SOD其一级结构的同源性均很高。,（二）SOD同工酶活性染色,Cu、Zn-SOD则一般是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量约为16000D，含一个铜原子及一个锌原子，不同来源的Cu、Zn-SOD其一级结构的同源性也很高。 2、SOD同工酶活性染色原理 由于三种SOD同工酶的分子量和电荷间存在差异，因此可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将三种SOD同工酶分开。,（二）SOD同工酶活性染色,电泳完后，根据SOD活性测定原理，将NBT溶液加入凝胶，在光照下，凝胶中不含SOD的地方，由于NBT进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈蓝色； 而在SOD同工酶谱带处，由于SOD抑制NBT的光化还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色背景下的透明带即为SOD同工酶谱带。通过这种方法，可观察到不同来源SOD同工酶之间以及同一来源不同发育阶段之间SOD同工酶的差异。,（二）SOD同工酶活性染色,3、材料与试剂 试验材料：新鲜植物叶片。 试验试剂：详见P117。 4、操作方法 各步操作方法及注意