《DNA测序技术》PPT课件.ppt

第七章,第一代测序技术的缺点,测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 测序反应费时费力科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 测序准确度不高DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误 测序基于PCR反应，需要引物并且有些结够复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。,GS FLX测序技术,原理：一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，实现测定DNA序列的目的。,优点与误差来源,优点：不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，分析结果快速、准确、灵敏度高且实现了自动化。 突出优势：较长的读长，其读长已超过400bp。 误差来源：454FLX测序的准确率在99%以上，其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号的强度中推断出来。这个过程可能产生误差。因此，454FLX测序的主要错误类型是插入/缺失，而不是替换。,Solexa优势与误差来源,技术优势：测序性价比最高，运行成本低； 可扩展的高通量； 需要样品量少； 简单、快速、自动化 误差来源：每次添加核苷酸之前对荧光信号的 切割，如果切割不完全，产生误差。,Heliscope单分子测序仪,原理：将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子并且在每个片段末端加上poly-A尾巴。通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息,Heli Scope的优势,单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低。 不需要扩增建立DNA库，从而减少误差。,SMRT技术,原理：SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应 。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。,SMRT测序流程,SMRT测序的特点及优势,特点：边测序变合成，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。 优势：1、速度很快，利用这种技术测序速度可以达到每秒10个dNTP 2、信号强度大。由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。,纳米孔单分子技术,原理：以-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。,纳米孔单分子测序的优势,1、准确度高，纳米孔单分子技术准确率能达到99.8%，且一旦发现替换错误也能较容易地更改。（因为4种碱基中的2种与另外2种的电信号差异很明显，因此只需在与检测到的信号相符的2种碱基中做出判断，就可修正错误。）