《基因表达的检测》PPT课件.ppt

基因表达检测,第三部分：,RT-PCR (Reverse transcription PCR),Reverse Transcription PCR,RNA抽提,cDNA,反转录,基因特异性引导 Oligo(dT)引导 随机六核苷酸引物引导,PCR,Northern Blotting,基因表达分析,Northern Blotting,Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.,基因表达水平,（梁大成等，2006）,表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析,（周斌，2001，硕士论文）,mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等,RNA操作中应注意的问题： 防止RNase污染,外源RNase的主要来源：,当处理RNA时，移液器专用 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用； 溶液和试剂分装成小份保存； RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；,防止外源RNase污染的主要措施(一）：,准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1的DEPC在37C处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。 180300C烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。,防止外源RNase污染的主要措施(二）：,材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步,防止内源RNA酶降解RNA,RNA酶抑制剂,RNA酶是一种强有力的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：,DEPC(Diethyl-pyrocarbonate) 或DMDC(Dimethyl-dicarbonate) 氧钒核糖核苷复合物 RNA酶的蛋白质抑制剂,DEPC:,是高度活性的烷基化试剂，通过组胺基团乙氧基甲酸化形式破坏RNase的活性,氧钒核糖核苷复合物:,能与多种RNA酶活性位点结合并几乎百分之百地抑制RNA酶的活性,RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor,可与RNase形成非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。,RNA EXTRACTION (mini prep),RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的，RNA的纯度和完整性对于Northern blot, RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。,实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片,苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。 Trizol Reagent,提取方法：,利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA,Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。,75乙醇（in DEPC-treated water) 氯仿 异丙醇（RNA专用） RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180C烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。,RNA抽提前应准备的其它试剂及物品：,操作步骤（一）,液氮磨样，每管分装0.1克样品； 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离； 加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；,4. 2-8 ，12000g 离心10-15分钟； 将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟； 2-8 ，12000g 离心15分钟； 弃上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g 离心5分钟，小心弃上清； 室温静置515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解，保存于-70 。 取2 l 琼脂糖电泳检测RNA质量。,操作步骤（二）,RNA的琼脂糖凝胶电泳,用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳 检测 0.5TBE,In 1 MOPS 80 150V 40 min 1h30min,电泳,有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。,What does good or bad total RNA look like when separated in gel?,Callus,Leaf,Degradation,Contaminant,Good,RNA产量低的原因,样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底 RNA没有完全溶解,RNA降解的主要原因,取样后没有立即抽提RNA； 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入-70 ，而不是-20 ） 使用的溶液或器皿有RNase污染 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5,DNA污染的原因,样品太多，所加试剂相对太少 用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙醇，DMSO等），或碱溶液等,RT-PCR (Reverse transcription PCR),实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA,目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。,实验原理,DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。Mg2+存在时，能在双链上产生切口；而Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片断化。 活性定义：以小牛胸腺DNA为底物，在25C、pH5.0的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位。,用途： 与DNA Polymerase I一起用于切口平移 体外转录后除去模板DNA Mn 2+ 存在下为鸟枪法测序（shot gun sequencing) 制作 DNA文库 用于足迹法（foot printing)分析 DNA-蛋白质相互作用,单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性（或RNase H），最适反应条件：37 C, pH8.3,反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,鼠白血病毒反转录酶 M-MLV：,禽成髓细胞反转录酶 AMV,2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNase H活性，最适反应条件41-45 C，pH8.3比pH7.6活性高,RNase H： 催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长带3羟基和5磷酸末端的寡核苷酸。,Ribonuclease Inhibitor,单一多肽，可与RNaseA形成1：1非共价的复合物，从而使RNA酶失活。不能在变性剂如SDS、胍等存在的情况下使用。活性表达需要巯基化试剂（DTT）,本实验以水稻叶片RNA为材料，检测-actin基因的表达。实验中设置一个阴性对照：不加模板RNA，主要是消除DNA及PCR试剂方面引起的假阳性；同时以叶片DNA为阳性对照，检验PCR试剂和扩增过程是否有问题,实验设计,操作步骤（一） RNA Preparation,Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent. Dilute the Total RNA to the final concentration of 1 g / l by DU640. . Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA 3l (2-5g) RNase-free DNase l (u / l) 10 DNase buffer 1 l add DEPC-treated ddH2O 5 l Incubate at 37 for 15 min, then 70 for 10 min.,操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction,Add 1 l 500 g / ml oligo (dT) 15 primer, mix the contents of the tube by gently vortexing and collect the reaction by brief centrifugation. Heat the mixture at 70 dry bath for 10 minutes, then put on ice for 5 minutes. Add the following contents: 5 first strand buffer 4 l 0.1 M DTT 2 l 10 M dNTP 1 l M-MLV (200 U / l) 1 l,操作步骤（二）,4. incubate at 37 for 1 h. (The total volume should now be 20 l) 5. Inactive the reaction by heating at 70 for 10 min, then add 20 l ddH2O and the first strand of cDNA can be used as a template to amplification in PCR. 6. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 l (2 units) of RNase H and incubate at 37 for 20 min.,PCR技术,PCR（多聚酶链式反应是一种体外扩增特异DNA片段的技术，是分子克隆技术中最常用的技术之一，是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性（denaturation，）退火（annealing）、延伸（extension）三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。,The Invention of PCR,Invented by Kary Mullis in 1983. First published account appeared in 1985. Awarded Nobel Prize for Chemistry in 1993.,模板DNA：一般102105个拷贝 Mg2：Mg2能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5 mmol/L 反应反冲液 ：使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。 dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为 20200 mol/L，浓度过高、过低都不利。 Taq DNA聚合酶：在7075C具最高活性。具有53的聚合酶活性和53的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。 引物：PCR反应中引物浓度一般为0.10.5 mol/L。,PCR反应体系中的主要成分及其作用：,变性：模板DNA由双链变成单链，使有利于与引物结合。可根据模板的复杂程度调整变性温度和时间，一般情况下94C 30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性（过高的温度或高温持续时间过长，可对Taq DNA聚合酶活性和dNTP分子造成损害）。 退火：变性的DNA快速冷却至4060C可使引物和模板DNA发生结合。可根据引物的长度和GC的含量选择复性温度。退火时间30秒。 延伸：一般是7075C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。1kb的可适当延长时间。 循环次数：理论上2025个循环PCR产物的累计即可达到最大值、实际操作中2530较合理。循环次数越多，非特异性产物的量也会增加。,循环条件的设定：,Thermal Cyclers,PCR machine available from many suppliers. Many block formats and multi-block systems. Reactions in tubes or 96-well micro-titre plates.,在冰上配制下列反应体系 : First strand cDNA 1 l TaKaRa Ex Taq (5 u / 1 l) 0.5 l 10 Ex Taq buffer 2 l dNTP mixture (2 mM) 2 l Primer F (10 mM) 0.5 l Primer R (10 mM) 0.5 l ddH2O 13.5 l 混匀后，短暂离心，每管加一滴矿物油。,操作步骤（三） PCR,PCR反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设置循环参数：如引物序列、引物长度、扩增片段的长度及mRNA 的丰度等,检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳； 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。,RT,反应程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 27 CYCLES. Genome: 750 bp cDNA: 250 bp,2KB cDNA ZH11 H2O,GAL4,反应程序： 94度 45秒， 58度 45秒， 72度 60秒， 30 CYCLES. Size : 630 bp,Taq酶过多； Mg2+浓度不合适； 引物浓度过高或设计不合理； 复性温度过低； 循环次数过多； 模板量过多；,PCR产物的电泳检测时出现拖带或非特异性扩增带的可能原因：,PCR扩增产物电泳检测,Opti