《基因的克隆与分离》PPT课件.ppt

,第五章 基因的克隆与分离,第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA 第二节 基因组文库的构建与基因分离 第三节 cDNA文库的构建与筛选 第四节 根据差异表达获得目的基因 第五节 基因的化学合成,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,RACE：根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）,第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA,1、根据基因编码蛋白同源序列，或多个同源基因cDNA序列设计（简并）引物，RT-PCR克隆核心序列，测序。 2、根据核心序列，设计新的引物进行cDNA的3端和5端的扩增。 3、拼接成 cDNA全序列的信息，设计新的引物扩增全长cDNA序列。,第一节 PCR扩增获得目的基因或cDNA,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,（二）经典RACE克隆原理： 3 RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3末端序列。 5 RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列，利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列。,5RACE,在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列,用oligo（dT）引发合成cDNA第一链,利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列,第二节 基因组文库的构建与基因分离,基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。 操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。,一、基因组文库（genomic library）,（2）目前常用的载体,二、 构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列： 容量为 23 kp cosmid载体： 容量为 45 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb,1、文库的完整性： 文库应包含基因组的完整序列信息 2、基因组信息的可重建性： 重建基因组的完整信息 3、文库的大小： 即文库中应包含的独立重组子数目,三、基因组文库应满足的条件,文库的大小：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln (1-P),ln (1-L/G),P：文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,L：克隆fragment的平均大小,G：Genome大小,N：所需的重组载体数（克隆数）,N=,4.61,G,L,例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp，所需的重组载体数：,N=,基因组文库实际克隆数：比计算值大2倍或3倍，或更高,四、基因组文库构建的一般步骤,2、大片段的制备,小孔喷射（10kb）、超声波（300bp）、机械搅拌（8kb）, 酶切法：,不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内切酶识别的位点数和酶解程度。 识别4对碱基的内切酶适用于制备120kb的DNA片段, 物理切割法：,1、染色体DNA的分离,如：Sau3A与BamHI的酶切末端。p108,3、载体的制备,内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段,左臂,可置换区,右臂,Sal I BamH I EcoR I,EcoR I BamH I Sal I,20kb,14kb,9kb,4、重组连接,左臂,插入片段,右臂,左臂,插入片段,插入片段,右臂,5、包装,6、重组噬菌体 感染大肠杆菌,基因组文库,五、基因组文库的筛选,筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来,探针筛选法： 两步或三步原位杂交法,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,cDNA library,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。,第三节 cDNA文库的构建与筛选,（1）以mRNA为材料，适用于RNA病毒 （2）文库小，构建容易，筛选简单 （3）每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列 （4）不含内含子序列，可进行原核表达,一、 cDNA文库的特点,cDNA文库应满足的条件： 文库的代表性：文库中重组cDNA分子是否可以完整的反映来源细胞中的表达信息，用库容量衡量。 序列的完整性：5UTR（容易丢失）、编码区、3UTR,p117,二、 构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,Trizol试剂提取，或商业化的试剂盒（kit）。,（2）mRNA的分离纯化,分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,反转录酶,（3）cDNA的合成, cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用RNase H识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物, 降解mRNA模板,RNaseH,mRNA,mRNA,mRNA, cDNA第二链合成,mRNA小片断为引物，合成第二链cDNA。,DNA Pol I除去引物并修补后，再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,DNA ligase,去引物,在双链cDNA末端接上人工接头（含限制性内切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,（4）cDNA与载体连接,接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,（5）重组载体转化受体菌,分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,三、文库的查询（screening）, 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。,Genomic library与cDNA library区别,一、cDNA末端的快速扩增（RACE）,根据已得到的不完整的cDNA序列设计引物对mRNA3端和5端进行克隆，可获得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意义）,上节内容回顾,（二）经典RACE克隆原理：,（一）RACE：,5RACE,在第一链cDNA的3端加上人工锚定序列,用oligo（dT）引发合成cDNA第一链,利用5锚定引物及3特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5末端序列,二、基因组文库的构建与基因分离,基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。,（一）基因组文库（genomic library）,（二）基因组文库应满足的条件,1、文库的完整性 2、基因组信息的可重建性 3、文库的大小,（三）基因组文库构建的一般步骤,（四）基因组文库的筛选,筛选：从众多的分子克隆群体中将确定的克隆筛选出来,探针筛选法： 两步或三步原位杂交法,（一）cDNA library,将某一生物的特定组织或特定发育时期细胞内的全部mRNA反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，这些cDNA克隆（包含着细胞全部mRNA信息）的集合称为该组织细胞的cDNA文库。,三、cDNA文库的构建与筛选,（二）cDNA文库应满足的条件,1、文库的代表性 2、序列的完整性,（三） 构建cDNA文库的一般步骤,（1）总RNA（total RNA）提取,（2）mRNA的分离纯化,（3）cDNA的合成,（4）cDNA与载体连接,（5）重组载体转化受体菌, 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。,Genomic library与cDNA library区别,第四节 基因差异表达获得目的基因,在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基因按时间、空间进行有序的表达方式，称为基因的差异表达。 真核基因总数约为100 000个，但在一定的发育阶段、在某一类型细胞当中，则只有15%左右的基因得以表达，产生出大约15 000种不同的mRNA分子。,一、 差异显示PCR（DDRT-PCR）,DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差异显示技术,（1）3 锚定引物,Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、G or C N: A、G、T or C,5,3,利用mRNA的poly A尾巴设计,利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增,12种锚定引物,3,这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示。 使用这种锚定引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。,（2）5端的随机引物,同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5端又设计了20种10bp长的随机引物。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,（3）用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增,12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,240组能分出20000多条带！,（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较,相同引物对在不同来源cDNA中的PCR产物并排电泳,选择有差异的带，回收测序，得到部分cDNA序列。 再通过筛选文库等各种方法获得全长cDNA或基因。,优点：速度快、操作简单、灵敏度高、样品需要量少等； 缺点：假阳性率高、获得的cDNA片段很短。,1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,第五节 基因的化学合成,一、化学合成目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法、,自动化合成法。,1、互补延伸连接法,二、化学合成DNA片断的组装,预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。,3,5,引物,（3）T4 DNA连接酶连接,T4多核苷酸激酶,完整的DNA双链,2、互补连接法,（合成的DNA单链的5端是-OH）,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。,1. 直接合成基因,2. 合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很难操作cDNA,3. 合成探针序列,4. 定点突变合成,合成带有定点突变