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荧光分析技术,重庆医药高等专科学校 唐倩,主要内容,一、发展历程,二、基本原理,三、荧光分析仪器,四、应用,第一次记录荧光现象(1575年）的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤 ； 1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置 ； 1952年才出现商品化的校正光谱仪器 ； 近十几年来，在其它学科迅速发展的影响下，推动了荧光分析法在理论方面的进展，相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世。,当紫外光照射到某些物质的时候,这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。利用这种能够反映物质特性的荧光来对该物质进行定性和定量分析的方法称为荧光分析法。,在稀溶液中，当实验条件一定时，荧光强度IF与荧光物质c的浓度成线性关系（这是荧光光谱法定量分析的理论依据）：,特点： a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便，重现性好。,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,仪器部件 a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。 c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。,1.同步荧光法,3.荧光探针法,2.导数荧光法,4.光化学荧光法,7.时间分辨荧光法,10.荧光免疫测定法,8.偏振荧光法,11.荧光成像技术法,6.荧光反应速率法,9.固体表面荧光测定法,5.低温荧光测定法,3.1 直接荧光法 直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的物质. 用直接荧光分析法进行药物定量分析时必须选择最佳pH范围。 已可用直接荧光分析法测定的药物有喹诺酮类药物、盐酸洛呱丁胺、双水杨酸和Meloxicam等,3.2 荧光淬灭分析法 荧光淬灭法是利用某物质对荧光物质的荧光猝灭作用而建立的对该物质的荧光测定方法。 荧光淬灭法可用于测定苦参碱、氧化苦参碱、对羧基苯丙酮酸、司帕沙星、甲硝唑等药物的含量。,3.3 衍生化荧光分析 利用金属络合的反应进行衍生 如测定了尿样中的司帕沙星。,3.3 衍生化荧光分析 利用荧光衍生剂进行衍生 如测定青霉素、阿奇霉素、加巴喷定、托吡酯的含量。,3.3 衍生化荧光分析 利用氧化还原反应进行衍生 氧化还原反应是还原剂将电子转移给氧化剂，其结果是有机物质分子结构发生改变，使其产生荧光或荧光强度增强，如测定替硝唑、异烟肼的含量。,3.4 胶束增敏荧光分析法 胶束增敏荧光分析法是在胶束溶液中对药物的含量进行测定的荧光分析方法。,3.4 胶束增敏荧光分析法 常用的环糊精(cyclodextrin,，CD)就是一种可以产生胶束环境的物质. 近年来，已经报道利用此种方法测定土霉素、吡哌酸、醋酸甲萘氢醌、盐酸芦氟沙星、醋酸泼尼松龙、双喀达莫、盐酸左氧氟沙星、左炔诺孕酮、曲克芦丁、维生素K、核黄素等得含量。,3.5 荧光动力学分析法 荧光动力学分析法主要包括催化荧光动力学和非催化荧光动力学两种类型。 有研究建立了阻抑动力学荧光法测定氨苄青霉素含量的新方法。,3.6 荷移荧光光谱分析法 近年来，荷移荧光光谱法在药物分析中得到了非常广泛的应用。文献报道用荷移荧光光谱分析法测定的有洛美沙星、加替沙星、环丙沙星、诺氟沙星、吡哌酸等药物。,4.1 荧光探针分析法 目前，林章碧等综述了纳米粒子作为荧光探针在生物分析中的应用，指出荧光探针分析法在药物分析中占有重要地位。 江崇球课题组利用稀土离子与四环素类药物生成配合物作为荧光探针来测定药物，以及对药物之间、药物与其他物质的相互作用做了研究。,4.2 同步荧光分析法 同步扫描技术与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长。由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图，这种用同步扫描技术得到的光谱称为同步荧光光谱。 同步荧光分析法按光谱扫描方式的不同可分为恒(固定)波长法、恒能量法、可变角法和恒基体法。,4.2 同步荧光分析法 和常规荧光分析法相比，同步荧光分析法具有谱图简化、选择性提高、光散射干扰少等特点。 它不仅可以对单一的药品进行分析，如异黄嘌呤、甲氧苄啶、依诺沙星等，还可以同时测定多种结构相似的药品。张国文等研究了西维因、蝇毒磷的荧光行为。,4.3 导数荧光分析法 导数荧光分析法记录的是待测物质荧光强度对波长的导数(包括一阶或更高阶导数)，从而获得相应的导数荧光的分析方法。 利用导数荧光光谱法对物质的浓度或者含量进行分析测定方法称为导数荧光分析法。 已经利用此种分析方法同时测定了多种氨基酸，维生素B，氧氟沙星对映体，环丙沙星等的含量。,4.4 化学计量学方法 化学计量学是数学、统计学、计算机技术和化学相结合的交叉学科。荧光分析法易受到散射光的干扰，无法同时分析混合物。化学计量学正好解决了这个问题。韩清娟等利用化学计量学方法直接测定了尿液中利血平的含量。,4.5 荧光联用技术 在现代分析化学技术中，多种分析仪器和检测方法的联用技术大大提高了分析检测的灵敏度，降低了检出限，达到了很好的效果。其中发展较快的有色谱-荧光检测技术和流动注射-荧光检测技术等,进一步系统地寻求和合