《操纵子中》PPT课件.ppt

操纵子,基因表达可以在转录、加工和翻译等多个水平受到调控。 基因的转录活性主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）和顺式作用元件（通常是DNA）之间的特异相互作用来调节。,1 引言,操纵基因是DNA上阻抑物结合、阻碍邻近启动子的启动而抑制转录的位点。 阻遏蛋白与DNA或RNA上的操纵基因结合，从而分别抑制转录或翻译。 结构基因编码RNA或蛋白质(包括结构蛋白、酶和调控蛋白）。 调控基因则通过编码蛋白质或RNA来调节其它基因的表达。,1 引言,调控基因编码的蛋白质作用于DNA的靶位点上。,1 引言,表达调控最简单的模型,2 调控可分为正调控和负调控,负调控中，阻抑物与操纵基因结合来阻止有关基因的表达。 正调控中，转录因子必须与启动子结合才能使RNA聚合酶起始转录。,负调控中，反式作用的阻抑物结合到顺式作用的操纵基因上以关闭其转录。,2 调控可分为正调控和负调控,正调控中，反式作用因子必须与顺式作用元件结合，才能使RNA聚合酶能在启动子处起始转录。,2 调控可分为正调控和负调控,2 调控可分为正调控和负调控,共同点： 调控蛋白作为反式作用因子，能识别那些通常位于基因上游的顺式作用元件，根据调控蛋白的自身性质，可激活或抑制基因表达。,对于同一条代谢途径中的某些蛋白质，通常编码它们的基因在DNA上也紧密排列在一起，并作为一个转录单位转录出mRNA。,3 结构基因簇中各成员是协同调控的,操纵子是细菌基因表达和调节的单位，包括结构基因和DNA上能被调控蛋白辨认的控制元件。,3 结构基因簇中各成员是协同调控的,lac操纵子包括顺式作用的调节元件和编码蛋白质的结构基因。长度约6000bp，。上游的lacI 具有自己的启动子和终止子。lacI 的末端紧接着启动子P。操纵基因O位于转录单位最前端26个bp, lacZ基因从第39个bp开始，随后是lacY 、lacA 基因和终止子。,3 结构基因簇中各成员是协同调控的,4 lac操纵子基因的表达受阻抑物控制,位于lac基因簇起点的启动子与操纵基因具有重叠区域，阻抑物与操纵基因结合就可控制该基因簇的转录。 阻抑物是由lacI基因编码的、具有4个相同亚基的四聚体。,在lac操纵子的转录起始位点周围，阻抑物和RNA聚合酶的结合位点是重叠的。,4 lac操纵子基因的表达受阻抑物控制,5 lac操纵子是可诱导的,可以对操纵子进行诱导的小分子结构通常与操纵子所表达的酶的底物结构相同或类似。 -半乳糖苷是lac操纵子编码的酶底物。 加入-半乳糖苷可诱导三个结构基因的转录。 由于lacmRNA极不稳定（半衰期为3分钟），因此诱导可被迅速逆转。,添加诱导物可引起lac mRNA的迅速产生,酶的合成则有一个短暂的延迟;去除诱导物可引起酶合成的快速终止。,5 lac操纵子是可诱导的,6 阻抑物由小分子诱导物所控制,诱导物可使阻抑物失活。 阻抑物具有两个结合位点，分别与操纵基因和诱导物结合。 当阻抑物与诱导物结合后，阻抑物发生别构效应使DNA结合位点的性质改变。,阻抑物与操纵基因的结合使lac操纵子处于失活状态；诱导物的添加可释放阻抑物，从而允许RNA聚合酶起始转录。,6 阻抑物由小分子诱导物所控制,7 用顺式作用的组成型突变来鉴定操纵基因,操纵基因的突变导致lacZYA的组成型表达（不受调控物所影响的持续表达）。 这些突变是顺式的，只影响邻近区域DNA上的基因。,操纵基因的突变是组成型的，因为操纵基因不能结合阻抑物；这使得RNA聚合酶得以通过启动子。Oc 突变是顺式作用, 因为它们只影响相邻的结构基因。,7 用顺式作用的组成型突变来鉴定操纵基因,7 用反式作用的突变来鉴定调控基因,lacI基因的突变是反式作用的,它可以影响细菌内所有lacZYA基因簇的表达。 使lacI基因失活的突变可以导致组成型表达。 因为阻抑物不能与操纵基因结合，所以阻抑物的DNA结合位点的突变是组成型的。 阻抑物上诱导物结合位点的突变使它不会失活，因而这会引起操纵子的非诱导性。,使lacI 基因失活的突变可引起操纵子的组成型表达，因为突变的阻抑物不能与操纵基因结合。,7 用反式作用的突变来鉴定调控基因,8 阻抑物结合于操纵基因上,阻抑物结合于操纵基因的双链DNA序列中。 操纵基因是26bp的回文序列。 操纵基因的每个反向重复序列结合一个阻抑物亚基。,lac 操纵基因具有对称性序列。按转录起始点为+1 ，将这一序列计数。阴影区表示对称的序列。,8 阻抑物结合于操纵基因上,9 阻抑物结合诱导物后从操纵基因上脱离,阻抑物与诱导物结合后发生构象变化，使它与DNA的亲和力降低，因而从操纵基因上脱离。,诱导物是与游离的阻抑物结合以干扰平衡（左），还是直接与结合在操纵基因上的阻抑物结合呢（右）？,9 阻抑物结合诱导物后从与操纵基因上脱离,10 阻抑物单体具有多个结构域,阻抑物单体可分为三部分：N端DNA结合结构域、铰链区和核心区。 DNA结合结构域具有两个短螺旋，用来与DNA大沟结合。 负责多聚化的区域和诱导物结合位点都位于核心区。,Lac阻抑物单体的结构，含有数个独立的结构域。,10 阻抑物单体具有多个结构域,11 阻抑物由两个二聚体组成四聚体,两个单体通过核心结构域2之间的接触和负责寡聚化的螺旋之间的接触形成二聚体。 两个二聚体通过寡聚化螺旋之间的相互作用形成四聚体。,Lac阻抑物核心区域的晶体结构表明了四聚体中各单体之间的相互作用。,11 阻抑物由两个二聚体组成四聚体,11 阻抑物由两个二聚体组成四聚体,11 阻抑物由两个二聚体组成四聚体,12 阻抑物与DNA的结合是通过别构作用来调节的,阻抑物单体的DNA结合结构域插入到DNA的大沟。 在活性阻抑物中，二聚体的两个DNA结合区域可以插入连续的双螺旋转角。 诱导物的结合使阻抑物构象改变，这样两个DNA结合位点不能形成正确的几何构象以维持与DNA的同时接触。,头段与DNA大沟上两个连续的转角结合。 诱导物的结合改变了头部与核心的相对取向，使头段不能与大沟结合，从而降低了与操纵基因的亲和力。,12 阻抑物与DNA的结合是通过别构作用来调节的,13 阻抑物与三个操纵基因结合并与 RNA聚合酶相互作用,阻抑物四聚体中的每个二聚体都可与一个操纵基因结合,所以一个阻抑物可同时结合两个操纵基因。 若要完全阻遏转录，阻抑物除了结合LacZ操纵基因外，同时还要结合一个上游或下游的操纵基因。 阻抑物结合到操纵基因可促进RNA聚合酶与启动子的结合。,当阻抑物四聚体与两个操纵基因结合时，两个结合位点之间的DNA被弯曲成一个紧密的环。（成环DNA中心的蓝色结构代表CAP，另一个结合在此区域的调节蛋白。）,13 阻抑物与三个操纵基因结合并与RNA聚合酶相互作用,14 操纵基因与低亲和力位点 竞争性地结合阻抑物,当诱导物不存在时，操纵基因与阻抑物的亲和力比低亲和力位点与阻抑物的亲和力高107倍。 每个细胞含10个阻抑物分子，这保证了在96%的情况下，操纵基因都是与阻抑物结合的。,14 操纵基因与低亲和力位点 竞争性地结合阻抑物,诱导使阻抑物与操纵基因的亲和力降到了原来的0.1%，这样只有3%的操纵基因是被结合的。 诱导使阻抑物从操纵基因直接转移到低亲和力位点。,Lac 阻抑物特异性地紧密结合在操纵子上，但它能被诱导物释放。所有平衡常数都为 M-1。,14 操纵基因与低亲和力位点 竞争性地结合阻抑物,事实上细胞内所有的阻抑物都与DNA结合。,14 操纵基因与低亲和力位点竞争性地结合阻抑物,阻抑物可作用于具有操纵基因靶序列拷贝的任何基因座。 自主调控 指的是基因产物或者抑制（负自主调控），或者激活（正自主调控）它本身的编码基因的表达。,15 阻遏可发生在多个基因座上,trp 阻抑物识别三个座位的操纵基因。保守碱基用红色表示。转录起点和mRNA是可变的。,15 阻遏可发生在多个基因座上,相对于启动子，操纵基因可能存在于不同的位置。,15 阻遏可发生在多个基因座上,调控线路,细菌基因调控是指基因表达受到调控因子的控制。 调控因子可能是蛋白质也可能是RNA。 蛋白质类调控因子通过变构效应来发挥作用（Lac阻抑物） 。 RNA调控因子通常是通过改变二级结构来发挥作用的。,1 引言,2 区分正调控与负调控,诱导可通过使阻抑物的失活来实现，也可通过活化其激活剂来实现。 阻遏可通过使激活剂的失活来实现，也可通过活化其阻抑物来实现。,2 区分正调控与负调控,负调控基因只有在没有阻抑物的情况下是一直表达的。 正调控基因只有存在活性调控因子时，它才会表达。,负调控中，反式作用的阻抑物结合到与顺式作用的操纵基因上以关闭其转录。,2 区分正调控与负调控,2 区分正调控与负调控,正调控中，反式作用因子必须与顺式作用元件结合，才能使RNA聚合酶能在启动子处起始转录。,调控线路是多种多样的，并且可设计成正调控或负调控来实现诱导或抑制。,2 区分正调控与负调控,3 cAMP是CAP的诱导剂， 可激活CAP作用于许多操纵子,CAP(分解物基因激活蛋白)是一种可以与某个启动子的靶序列结合的激活剂。 CAP二聚体可以由cAMP分子激活。,调控线路是多种多样的，并且可设计成正调控或负调控来实现诱导或抑制。,4 cAMP是CAP的诱导剂，可激活CAP作用于许多操纵子,cAMP有一个磷酸基团能够与糖环的 3和5 位结合。,4 cAMP是CAP的诱导剂， 可激活CAP作用于许多操纵子,通过降低cAMP水平使得葡萄糖抑制操纵子的转录，而cAMP水平对CAP的活性是必需的。,4 cAMP是CAP的诱导剂，可激活CAP作用于许多操纵子,5 CAP在不同的靶操纵子中的作用方式不同,相对于启动子的位置，CAP的结合位点是高度可变的。 CAP与RNA聚合酶相互作用，但具体的反应还依赖于CAP结合位点与启动子的相对位置。,CAP的共有序列中含有非常保守的五聚体 TGTGA 及一个该序列的反向序列 (有时出现) (TCANA).,5 CAP在不同的靶操纵子中的作用方式不同,CAP蛋白可在不同位点与 RNA 聚合酶结合。,5 CAP在不同的靶操纵子中的作用方式不同,CAP在它的结合位点可使DNA成90度弯曲。,6 CAP促使DNA弯曲,凝胶电泳技术可用来分析折叠弯曲的情况。,6 CAP促使DNA弯曲,CAP可在中心对称处将 DNA弯曲成 90,6 CAP促使DNA弯曲,7 应急应答产生(p)ppGpp,不利的生长环境促使细菌产生小分子调控因子ppGpp（鸟苷酸四磷酸核苷）和pppGpp（鸟苷酸五磷酸核苷） 。 ppGpp水平和细菌生长速率一般呈相反关系。,8 (p)ppGpp由核糖体生成,应急因子RelA是一种（p）ppGpp合成酶，约与5%的核糖体结合在一起。 当核糖体A位被空载tRNA占据时， RelA被激活。 一个空载tRNA进入A位就生成一个（p）ppGpp。,应急因子催化 pppGpp 和 ppGpp的合成； 核糖体蛋白能够使 pppGpp 去磷酸化成为 ppGpp。,8 (p)ppGpp由核糖体生成,在通常的蛋白质合成中，在 A 位存在氨基酰 -tRNA是转肽酶进行肽链转移的信号，随之核糖体在 EF-G的催化下移动；但是在应急条件下，当存在空载tRNA 时，会促使RelA 蛋白合成 (p)ppGpp ，并驱逐 tRNA。,8 (p)ppGpp由核糖体生成,9 ppGpp有许多作用,ppGpp阻止rRNA的转录。 在编码rRNA的操纵子中，启动子上转录起始被特异性地抑制。 ppGpp能缩短许多或大部分模板的转录延伸期。,核苷酸水平调控了rRNA转录起始。,9 ppGpp有许多作用,