一般毒性作用分解.ppt

1,第六章 一般毒性作用,2,一般毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。,防治急慢性中毒； 安全性评价和危险度评定； 制订卫生标准； 管理毒理学的决策,3,第一节 急性毒性作用,4,机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,注意：次数；时间；强度,5,二、急性毒性试验的目的,1求出致死剂量及其他急性毒性参数,2观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征。,3为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据。,4为毒理学机制研究提供线索。,6,急性毒性反应与人近似； 易于饲养、操作方便； 繁殖力较强，数量较大； 价格较低，易于获得,（一）实验动物的选择和要求,三、急性毒性试验方法的要点,7,1实验动物的物种和品系,啮齿类（rodent species）,非啮齿类（nonrodent species）,小鼠：昆明种、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar,犬或猴,8,根据接触途径选择实验动物,急性经口和吸入毒性试验 大鼠、小鼠；,急性经皮毒性试验 成年大鼠、豚鼠、家兔。,9,大鼠：180-240g； 小鼠：18-25g； 家兔：2-2.5kg；,2实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物,豚鼠：200-250g； Beagle犬：4-6kg； 杂种犬：8-15kg。,同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%。,10,雌雄各半； 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值； 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验。,3实验动物的性别,11,根据组数和每组数量来决定数量。不同的LD50计算方法对动物组数的要求有所不同，一般为4-6组。,4实验动物分组与数量,动物分组时应严格遵循随机化的原则，提高组间均衡性，减少非处理因素对试验结果的影响。,12,5实验动物的预检,适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响； 筛检健康状况不符合试验要求的动物。,6实验动物的给药前禁食处理,经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰。,13,（二）受试物及处理,常用剂型为水溶液、混悬液、油溶液,水溶性受试物，胃肠道外染毒需用生理盐水，保持与体内渗透压一致。 水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中。 受试物一般应临用前新配,14,适宜容积染毒, 经口：20ml/kg(空腹动物)； 经皮：2ml/kg； 静脉：1ml/kg(5min以上)； 肌肉注射：0.5ml/kg(一个部位)； 眼睛：0.01ml/每眼； 直肠：0.5ml/kg； 阴道：大鼠0.2ml，兔lml； 吸入：2mg/L； 鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。,15,模拟实际接触的途径和方式； 有利于不同化学物之间结果的比较； 受试物的性质和用途； 受试物毒性评价程序的要求,(三) 染毒方法,16,工业毒物：经呼吸道、皮肤； 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道； 药品：经口、注射； 食品：经口； 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤,染毒途径,17,染毒途径影响受试物急性毒性,静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射经皮。 同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律。,18,1. 经口（胃肠道）染毒,通常以经口途径的LD50值来比较不同化学物急性毒性大小。,灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法；,吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。,喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入。,19,吸入染毒 静式吸入染毒； 动式吸入染毒。,2经呼吸道染毒,气管内注入,20,静式吸入染毒,方法：将实验动物置于有一定体积的密闭容器中，加入液态或气态受试物，形成一定浓度的受试物空气环境进行染毒。,缺点：氧气减少；浓度不稳定；经皮吸收；不适合稍大动物；挥发性。,优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠。,21,动式吸入染毒,将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制。,22,动式吸入染毒设备,23,24,动式吸入染毒装置的组成,染毒柜； 机械通风系统； 配气系统,动式吸入染毒方式分类,动式吸入接触（动式染毒）； 面罩接触（面罩吸入染毒）。,动式吸入染毒的优、缺点,25,3经皮肤染毒,脱毛：化学法脱毛或机械法脱毛（体表面积的10%）。,染毒：局部涂敷受试物或大鼠、小鼠浸尾法染毒。,26,静脉注射或滴注； 腹腔注射； 肌肉注射； 皮下注射； 皮内注射； 椎管内注射,4经注射途径染毒,27,先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围。,（四）剂量选择,参考相关资料,参考新化学物的理化性质,根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数。一般设5-8个剂量组；霍恩氏法设4个剂量组。,28,各组剂量的计算,i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i=（lgLD100- lgLD0）/（n-1）,以最低剂量值（LD0或LD10）的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组。,29,化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大。 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡，方可不进一步试验求出LD50值。,30,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现。,（五）毒性作用观察,中毒体征及发生过程； 死亡情况和时间分布； 体重； 病理形态学变化。,31,详细观察和记录动物出现的中毒体征、发生时间和体征发展的经过。,1中毒体征及发生过程,机体对毒物作用的反应可以表现出各个系统的特征。不同系统的毒性表现可不一样；或某一中毒体征和行为的改变反映多个系统的毒性。,32,33,续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现,34,实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响。,2死亡情况和时间分布,分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息。,35,实验动物体重变化可以反映动物中毒后综合性整体变化。 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次。,3体重,36,体重变化的原因,影响食欲或消化系统的功能； 影响食物的吸收和利用； 影响水的摄取； 肾功能急性损伤,37,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变； 存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查。,4病理检查,38,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况。,（六）观察时间和周期,给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束。,39,急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小。,四、急性毒性分级和评价,40,41,42,第二节 蓄积毒性作用,43,外源化学物连续地进入机体，且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量，化学物质可能在体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学物质的蓄积作用(accumulation)。,一、蓄积毒性的基本概念,44,机体常见的储存库有血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。,储存库（depot）,化学物质易蓄积的组织部位,45,反复多次接触化学毒，可以用分析方法测出体内物质的原型或其代谢产物。,物质蓄积（material accumulation）,长期接触某些化学毒物后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。,功能蓄积（functional accumulation）,46,以生物效应为指标，用经验系数（K）评价蓄积作用的方法，即将多次染毒与一次染毒所产生的毒性效应进行比较。,（一）蓄积系数法,二、蓄积作用的研究方法,简便，但不能区分化学毒物的蓄积性是物质蓄积还是功能蓄积。,47,多次染毒使半数动物出现效应的蓄积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的蓄积剂量ED50(1)的比值。,K=ED50(n) / ED50(1),K=LD50(n) / LD50(1),蓄积系数（accumulation coefficient）,48,化学毒物在动物体内全部蓄积或每次染毒后毒效应是叠加时，LD50(n)等于LD50(1)，即K=1；,反复染毒时实验动物对化学毒物发生过敏现象，可能出现K1。,49,蓄积系数法常用的实验方案,1固定剂量法,动物：大、小鼠； 染毒途径：经口灌胃、腹腔注射； 方法：先求LD50，然后选取相同条件的40只（或更多）实验动物，随机分为两组，一为染毒试验组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。,50,在1/20-1/5 LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量，定时和相同途径对试验组进行染毒，观察记录动物死亡数。,试验组累积发生一半动物死亡即终止试验。计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算K值，然后进行评价。,接触剂量累积达5个LD50，可终止试验，K5。固定剂量法试验期为25-100天。,51,开始：按0.1 LD50剂量染毒，4天为一期。,2剂量递增法,第五天起：每4天为一期递增1.5倍，即0.15LD504天，0.22LD504天，依次类推。,52,基于蓄积系数的原理而设计。 灌胃染毒。 阴性对照和1/20 LD50、1/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50四个剂量组，每组10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。,3剂量固定的20天蓄积法,53,各剂量组均无死亡，蓄积性不明显； 如仅1/2 LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性； 如1/2 LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积； 如LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,评定标准,54,用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。,（二）生物半减期法,t1/2较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。,（biological half-life，t1/2）,55,56,第三节 亚慢性和慢性毒性作用,57,实验动物或人连续较长期接触外源化学物所产生的中毒效应。实验时间通常为1-6个月。,一、亚慢性毒性作用,（一）亚慢性毒性,(subchronic toxicity),58,研究亚慢性毒性剂量-反应(效应)关系，确定NOAEL和LOAEL，提出安全限量参考值； 观察亚慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官； 观察亚慢性毒性作用的可逆性； 为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供依据； 为其他试验中发现的或未发现的毒作用提供新的信息， 比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。,（二）亚慢性毒性实验的目的,59,实验动物对受试物的生物转化、生理生化、毒性反应与人类相当或相似。,（三）亚慢性毒性试验方法的要点,1. 实验动物的选择,(1) 物种和品系,两种实验动物，啮齿类和非啮齿类。,60,两种性别，每组雌雄各半； 性腺或生殖毒性，可选单性别的动物； 一般选择离乳不久的动物，大鼠6-8周龄（体重80-l00g）； 同组动物体重相差不应超过平均体重的10%，组间平均体重不超过5%。,(2) 性别、年龄和动物数,61,尽可能使用高等级实验动物，在符合国家实验动物标准的试验环境中进行； 国家实验动物微生物学和寄生虫学等级及监测分类，分四级：普通级、清洁级、无特定病原体级(SPF级)、无菌级。,(3) 微生物学寄生虫学等级和饲养环境,应使用清洁级及以上等级大小鼠，并饲养在屏障环境内进行试验。,62,(1) 经口染毒途径的方式,灌胃法； 喂饲法； 胶囊法,2染毒方式,(2) 经呼吸道染毒的时间,每日2-6h，工业毒物可以缩短至1h，环境污染物可延长至8h。,63,犬静脉注射比较易行、常用,(3) 注射,长期反复腹腔注射应注意无菌操作,长期反复的直肠用药、眼睛用药等，较难进行，常不能确保给药量的准确。,(4) 特殊染毒途径的试验,64,为了维持实验动物体液中有一个准确的血药浓度水平，保持受试物生物学效应每日相似性，亚慢性毒性试验每日染毒的时间应保持一致。一般在每日上午进行，给药后喂食。,(5) 毒代动力学血药浓度监测,65,3剂量选择和分组,高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于10%）； 中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）； 低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（NOAEL）。,66,农药、食品添加剂、工业化学品和其他非药用化学物试验剂量选择的基本原则有很多相似之处，但由于各自具有专业特殊性以及管理部门的不同，均有各自不同的剂量设计规范要求。,67,4. 观察指标,1,2,3,4,68,外观体征和行为活动、粪便性状、食量及体重变化等，常常能综合反映毒物对机体的毒作用，往往是敏感的综合毒效应指标。应详细记录，仔细分析，从中发现化学毒物的毒性特征。,(1) 一般性指标,69,每日观察外观体征和行为改变，记录时间和先后次序，包括食欲、活动、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等；留意动物被毛的光洁度与色泽、眼分泌物、呼吸、神态、行为等。,1) 外观体征、行为活动,有助于分析化学毒物损害机体的部位及程度。,70,受试组动物体重增长比对照组低10%,2) 动物体重,提示是由受试物引起的毒效应； 存在剂量-反应关系，则可以肯定是一种毒性效应。,71,食物利用率：每食入100g饲料所增长的体重克数（g体重/100g饲料）,3) 饲料消耗量,喂饲法染毒时，可计算各组动物实际染毒剂量。 比较各染毒组与对照组动物的食物利用率，有助于了解化学物的毒性效应。,72,血、尿等体液的实验室检查目的是发现受试物所致器官损伤和功能紊乱，体内生化转化和排泄的重要器官肝和胃的功能是检查重点，血液是另一个重要的靶器官。,(2) 实验室检查,73,红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等。,1)血液学检查,2)血液生化检查,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Crea)、总胆固醇(T-CHO)等。,74,外观、pH值、蛋白、糖、潜血和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息。,3) 尿液检查,75,试验结束时系统解剖，进行详细的肉眼检查，测定脏器重量并作组织病理学检查。在试验中间死亡或处于濒死状态的动物，亦应作及时的系统尸解和病理学检查。,(3) 系统尸解和组织病理学检查,76,某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量，表示为脏器质量（g）/体重（100g）。,1) 脏器重量和脏器系数,脏器系数,77,大体检查、常规组织病理学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查等，分别从大体、组织、细胞、亚细胞，甚至分子水平等多个方面发现化学毒物的毒效应。,2) 病理学检查,78,除了上述检查指标外，可根据受试物毒性资料、试验中的观察和受试物的结构等线索增加一些检查项目。,(4) 其