《菊花的组织培养》PPT课件.ppt

专题3,植物组织培养技术,2,(一)组织培养定义,组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养。,一、基础知识,4,（二）植物组织培养的分类 广义的组织培养依外植体不同，可分为： 1) 器官培养（organ culture） 2)茎尖分生组织培养(shoot tip culture, apical meristem culture) 3)愈伤组织培养(calluse cultrue) 4)细胞培养(cell culture) 5)原生质体培养(protoplast culture),（二）植物组织培养应用领域 1、快速繁殖： 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。 2、种苗脱毒 ： 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。 3、远缘杂交： 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。,4、突变育种： 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。 5、基因工程： 基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。 6、生物制品： 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物-紫杉醇等，可通过组织培养方式生产。,（三）植物组织培养的基本过程,(四) 植物的组织培养的有关概念,1.细胞的分化,（1）概念：,在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,（3）结果：,形成不同的细胞和组织,（2）原因：,基因在特的时间和空间条件下的选择性表达的结果,（4）特点：,稳定性：,全能性：,持久性：,是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度,细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的,已分化的细胞，仍具有发育的潜能,2.细胞的全能性,定义：,生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性,原因：,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因,高度分化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性。,已分化的植物细胞，仍具有全能性,实例,受精卵生殖细胞体细胞,全能性的比较:,1.什么叫外植体？ 2.什么叫愈伤组织？ 3.愈伤组织的细胞有什么特点？ 4.什么叫脱（去）分化、再分化？ 5.如何控制细胞的脱分化与去分化？,思考题：,从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官,在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。,细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞,人参的愈伤组织,菠萝的愈伤组织,（六）影响植物组织培养的因素,1.植物材料的选择,例如：烟草和胡萝卜的组织培养较为容易； 枸杞愈伤组织的芽诱导比较难,同一种植物材料，其年龄、保存时间的长短也会影响实验结果,例如：菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝,不同的植物组织，培养的难易程度不同,2.不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基,MS培养基主要成分包括：,A、大量元素: C、H、O、N、P、 S 、 K、Ca、Mg,B、微量元素: B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co,C、有机物： 甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等 D、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等,讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素类：,赤霉酸（GA3）,3.植物激素的影响,生长素和细胞分裂素作用,植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响,4、消毒 在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境。 5、pH、温度、光照 菊花： pH=5.8 温度控制在1822 每日光照12h,制备MS固体培养基,外植体消毒,接种,培 养,栽 培,二、实验操作,移 栽,冲洗酒精无菌水冲洗氯化汞无菌水冲洗至少三次之上,（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,1、配置各种母液,2、配置培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml, 配制培养液, 调PH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,思考： 你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,1、愈伤组织的培养,从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养,继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为11.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养,2、愈伤组织的继代培养,在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色,3、试管苗的培养,当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,3、移栽,珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培,幼苗长壮后，移栽到土壤中,（六）栽培,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,此时的组织或细胞为离体的，即细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不是能体现其整个植物体的光能自养,在培养过程中，是脱分化、再分化的过程，随着芽和根的形成，就具有了自养的能力，是由细胞到一个个体的演变过程,1、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？,2、培养过程中为什么需要进行光照,思 考,？,1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌） 2、外植体的消毒（酒精、氯化汞） 3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧） 4、无菌箱中的培养； 5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。,1、在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？,三、结果分析与评价,（一）对接种操作中污染情况的分析 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 （三）是否进行了统计、对照与记录 （四）生根苗的移栽是否合格,四、课题延伸,1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养,2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季,1、植物学家将胡萝卜的韧皮部细胞分离出来，将单个细胞放在特定的培养基中培养，获得了许多完整的植株，这些植株的特点是( ) .彼此性状极为相似 .都是单倍体植株 .植株的变异频率较高 .都是纯合体植株,2、根据分裂潜能，干细胞可分为全能干细胞（可发育成完整的个体）、多能干细胞（可发育成多种组织和器官）和专能干细胞（发育成专门的组织和器官），则这些细胞在个体发育中的分化顺序是( ) .全能专能多能 .全能多能专能 .多能全能专能 .专能全能多能,练 习,21.下图是植物组织培养的简略表示。据此回答： ,3、下图是植物组织培养的简略表示。据此回答： （1）表示_，它能被培养成为的根本原因是_。 （2）表示_，它与相比分化程度_，全能性_。 （3）若想制成人工种子，应选用_。 （4）若是花药，则是_，继续对其使用_处理可获得_正常植株，该过程称为_。 （5）若是胡萝卜根尖细胞，则培养成的叶片的颜色为_，这说明_。 （6）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的药物紫草素，培养将进行到_。,答案： （1）离体的植物组织或器官 植物细胞具有全能性 （2）愈伤组织 低 高 （3） （4）单倍体植株 秋水仙素 纯合体 单倍体育种 （5）绿色 含有表达叶绿体的基因 （6）,4、 基因型为AaBb的水稻（含24条染色体）的花药通过无菌操作接入试管后，在一定条件下形成试管苗，问： （1）愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得_等营养物质。 （2）要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有_和_两类激素。 （3）愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，再由芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照，其原因是_能利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。 （4）试管苗的细胞核中含_条脱氧核糖核苷酸链。 （5）培育成的试管苗可能出现的基因型有_。,答案： （1）水、无机盐、维生素和小分子有机物 （2）细胞分裂素 植物生长素 （3）叶绿体 （4）24 （5）AB、aB、Ab、ab,课后练习： 1.答：植物组织培养所利用的植物材料体