基于微流控芯片的纳米颗粒与细胞相互作用模拟

单位代码 学 号 10101005 分 类 号 毕业设计(论文)基于微流控芯片的纳米颗粒与细胞相互作用模拟 院（系）名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名李璇 指导教师孙佳姝 2014年 5 月 基于微流控芯片的纳米颗粒与细胞相互作用模拟李璇北京航空航天大学北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 基于微流控芯片的纳米颗粒与细胞相互作用模拟 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：原始资料：1.本课题组已进行的相关研究及研究结果； 2.本课题组已初步设计的芯片制作、细胞图案化技术方案； 3.课题开展前期进行的文献调研：微血管系统造影图片、纳米颗粒的生物医学应用及其在微循环系统中输运情况的研究、微流体数值模拟、微纳尺寸颗粒与细胞相互作用的研究。 技术要求：1.PDMS 微流控生物芯片的制作； 2.细胞培养技术、细胞图案化技术； 3.荧光显微镜、共聚焦显微镜、微流泵的使用； 4.纳米颗粒扩散的基本知识及其与细胞相互作用的表征； 5.微流体力学基本知识及计算。 、毕业设计（论文）工作内容：1. 分析人体和仓鼠微血管系统造影图，基于人体内微血管的形状及尺寸，简化变量，提取结构单元，设计模拟其结构的微流道，并制作硅片模版。 2. 基于硅片模版，制作PDMS微流道芯片。 3. 利用细胞图案化技术，将内皮细胞种植于PDMS微流道底面，并实现在芯片上的连续细胞培养。 4. 研究荧光标记的纳米颗粒在微血管系统的流道中，其在内皮细胞表面粘附和被内皮细胞吞噬的情况，对不同部位的颗粒分布（如分支分叉、截面积突变等）进行量化的分析和对比。 5. 学习微流体力学基本知识以及其数值模拟方法。 6. 解释实验结果，探讨实验结果对体内纳米颗粒与细胞相互作用分析纳米药物载体设计的意义，完成毕设论文。 、主要参考资料：1 The influence of size, shape and vessel geometry on nanoparticle distribution, Jifu Tan et al., Microfluid and Nanofluid, 2013 Jan 1, 14(1-2):77-87 2 Influence of red blood cells on nanoparticle targeted delivery in micro- circulation , Jifu Tan et.al, Soft Matter, 2011 December 22;8: 19341946 3 A microfluidic device for monitoring siRNA delivery under fluid flow, A.D. van der Meer et al., Abstracts/Journal of Controlled Release, 132(2008):e42e44 4 Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Balabhaskar Prabhakarpandian, et al., Biomed Microdevices, August 2008,Vol.10, Issue 4,585595 5 A Physiologically Realistic in Vitro Model of Microvascular Networks. Jenna M. Rosano, et al., Biomed Microdevices. October 2009, Vol.11, Issue 5, 1071-1057 生物与医学工程 院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 李璇 毕业设计（论文）时间：自 2014 年 2 月 20 日至 2014 年 6 月 5 日答辩时间： 年 月 日 成绩 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 教研室主任 北京航空航天大学毕业设计(论文) 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：李璇签字：时间：2014 年 5 月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 IV 页基于微流控芯片的纳米颗粒与细胞相互作用模拟学 生：李璇 指导教师：孙佳姝（国家纳米科学中心）校内指导：李舟摘 要纳米颗粒是新兴的药物载体和体内成像探针。纳米颗粒在与血管壁细胞相互作用并穿透管壁后才能达到靶点，因此研究其在微血管系统中的运输及与血管壁内皮细胞的相互作用，对实现高效的靶向运输具有重要意义。微流控芯片自20世纪90年代被提出以来，广泛应用于流体力学、组织工程等领域。在微流道表面修饰内皮细胞层后，微流控芯片成为研究纳米颗粒在微血管系统中运输的良好平台。在本项目中，我们分析人和仓鼠微血管网络造影图，提取了微血管网络的主要几何要素：分支分叉、管径变化、弯曲和转角，设计并制作了基于以上结构的PDMS（聚二甲基硅氧烷）微流控芯片，在微流道中植入单层人脐静脉内皮细胞，实现了在微流控芯片上对微血管系统基本结构的体外模拟。基于以上装置，我们采用100nm的绿色荧光聚苯乙烯颗粒对纳米颗粒与内皮细胞在微血管中的相互作用进行了研究。实验发现，在较低流速（10L/h）和较高流速（20L/h）下，细胞与纳米颗粒相互作用后的荧光强度，均高于静止状态下两者相互作用同等时间后的荧光强度，且较低流速下的荧光强度最强。在管径突缩狭窄处，流速剧增使管壁剪切率剧增，细胞无法耐受，故在血管狭窄处易发生贴壁细胞的损伤和流失。而在微流道分叉处，纳米颗粒因其自由扩散系数较低，其运输行为按照流体的流动分布。在管径不等的分叉中，纳米颗粒随液流主体进入阻力较小的较宽分叉流道；在管径相等的分叉中，纳米颗粒均匀进入两分叉流道。本项目提供了研究纳米颗粒体内运输情况的新方法，该结果对纳米药物的开发设计及其体内运输的机理研究有重要意义。关键词： 纳米颗粒， 微流控技术，细胞与颗粒的相互作用Microfluidic Chip-Based Analysis of Nanoparticle-Cell Interaction Author：LI Xuan Tutor: SUN Jiashu AbstractNanoparticles (NPs) are emerging as promising carrier platforms for targeted drug delivery and imaging probes. To bind at the target region, NPs have to interact with the vascular endothelialcells, and pass through microvascular walls. To evaluate the target delivery efficiency of nanomedicine, it is important to find out the distribution of NPs within blood vessels, and how they interact with vascular endothelialcells. Ever since the microfluidics technology came into being in 1990s, microfluidic chips have been broadly used in hydromechanics and tissue engineering. After coating microfluidic channels with endothelialcell-layer, microfluidic chips become excellent platform for analyzing NP-cell interaction. Here in the study, we extracted the main block-geometries of microvascular networks after analyzing the angiography images of human and hamster: bifurcation, cross-sectional variation, curve and angle. PDMS microfluidic channels were designed and fabricated based on these four geometries, and a single layer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was planted on the channel bottom, realizing the on-chip simulation of microvascular system. 100nm polystyrene NPs with green fluorescence were used to study NP-cell interaction on the chip. Experiments here show that under both low (10L/h) and high (10L/h) flow-rate conditions, HUVECs have higher fluorescence intensity after interacting with NPs than those under steady condition. The flow speed and wall-shear rate increase dramatically in channel-narrows, causing the damage and loss of endothelial cells. When it comes to bifurcations, the distribution of NPs follows the fluid pattern, as NPs possess weak diffusion movement. For channels with unequal widths, NPs will mainly enter into the wider one after bifurcation; for channels with equal widths, there are similar amount of NPs entering into both channels after bifurcation. This study would provide valuable information for NP distribution in a complex vascular network.Key Words: Nanoparticles, Microfluidics, Cell-Particle Interactions目 录1. 绪论11.1研究意义11.2研究现状分析31.2.1纳米颗粒在微血管系统中运输情况的研究31.2.2微流控芯片技术的发展现状41.2.3微流控芯片上细胞网络的建立91.2.4在微流控芯片上研究颗粒运输情况的现状101.3项目研究内容132.实验材料和方法142.1微流控芯片模版的制备142.1.1仪器及试剂用品142.1.2 AutoCAD微流道制图142.1.3光刻制作微流道模版152.2 软模版刻蚀法制作PDMS微流道芯片162.2.1仪器及试剂用品162.2.2 微流道芯片的制作步骤172.3微流道芯片底面内皮细胞网络的建立182.3.1 仪器及试剂用品182.3.1人脐静脉内皮细胞的培养 192.3.2 微流道底面内皮细胞层的种植202.4荧光纳米颗粒溶液的制备202.5微流道内纳米颗粒与细胞相互作用212.5.1仪器及试剂用品212.5.2向微流道内通入纳米颗粒的具体操作212.6细胞荧光强度的分析与统计222.7采用COMSOL对微流道内底面流体速度分布进行数值模拟223. 实验结果分析与讨论233.1 微流道底面内皮细胞网络的建立233.2 流速对细胞吞噬纳米颗粒的影响253.3 管径突变处流体对内皮细胞的影响293.4 管道分叉处纳米颗粒与细胞相互作用分析314结论与展望38致谢40参考文献41北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 46 页1. 绪论1.1研究意义近年来，纳米颗粒在药物载体和体内成像探针等方面的应用得到了广泛关注和深入研究12。脂质体、“多聚物药物”结合体等纳米颗粒比传统的药物在靶向运输、缓释效果、双重成像、治疗效果等方面都有很大提高。脂质体阿霉素、脂质体两性霉素B、脂质体吗啡等纳米颗粒等药物已经陆续通过FDA的批准，投入到临床医学应用中3。纳米颗粒药物要到达作用靶点发挥作用，必须经过循环系统。但是目前，尚未有针对纳米颗粒在微血管系统中的运输情况进行的系统详尽的研究。纳米颗粒在微血管系统中的运动符合Taylor-Aris作用规律，即先从血流主体迁移到血管壁，与血管壁细胞相互作用，穿透管壁，最终到达指定的疾病和造影靶点45。靶点的药物浓度既要足以实现疾病治疗和体内造影的需要，又要在有效浓度范围之内尽量减小，以防止高剂量带来的副作用4。因此，研究纳米颗粒在微血管系统中与血管壁内皮细胞的相互作用情况，特别是在管壁细胞中的沉积情况，对于实现其高效、有效的靶向运输具有十分重要的意义。对于用于肿瘤治疗的纳米药物载体来说，其粒径范围一般被设定在100300nm6。纳米颗粒药物载体要想通过肿瘤部位的新生血管而达到靶点并杀死癌变细胞，需要穿透新生血管壁表面的通透间隙，该效应即为“增强性的滞留和穿透效应”（Enhanced Retention and Permeability, 简称EPR效应）。肿瘤部位新生血管的通透间隙数量级为几十到几百纳米，但是当颗粒尺寸小于100nm时，纳米颗粒极易在肾脏部位进入排泄系统被排出体外，其在体内的停留时间无法达到其发挥作用所需的最低要求7。纳米颗粒与管壁细胞中的相互作用情况，特别是其在管壁细胞表面的粘附和吞噬情况，受到多种因素的影响：包括颗粒的尺寸、结构（形状）、表面化学性质，局部流体状态，血液的流变学性质，局部血管流道结构等45。直接观察并分析颗粒在血管中的运输和粘附情况是难以实现的，不仅目前的活体成像技术水平难以达到该要求，而且我们无法直接从活体观察的结果中单独分析各种作用因素的具体影响8。微流控芯片技术自20世纪90年代被提出以来，其制作技术不断纯属，应用领域不断拓宽, 已经广泛应用于流体力学、组织工程、免疫检测等方面9 10。微流控芯片技术的发展使得通过体外制备的微流道体系研究该问题成为可能。但是目前报道的研究结果多采用直流管道，因而无法准确模拟微血管系统的复杂结构（分支分叉、截面积变化、迂回弯曲等）1112。本项目旨在于微流道芯片上建立模拟人体内微血管系统的流道体系，从而实现模拟体内环境，对纳米颗粒在流道中的运输以及其与细胞的相互作用进行研究。本项目的创新意义在于，采用微流控芯片研究纳米颗粒在微血管内的分布、粘附以及其与细胞的相互作用。这是在纳米药物载体领域具有创新性的研究方向。首先，PDMS（聚二甲基硅氧烷，polydimethylsiloxane）微流控芯片可以高仿真的模拟各种微血管结构，而微流道内的化学物理环境可以实现均一、可控，因此是模拟微血管内环境的良好平台13。第二，我们在分析人和仓鼠微血管系统造影图片的基础上，制造出简化的微血管系统重要部件模型，该设计相比于早期研究颗粒与细胞在流体刺激条件下相互作用的直流管道有巨大优势，因为它可以更加形象地模拟微血管系统，研究在分支分叉、截面突变等部位颗粒的沉积情况。第三，在微流道底面覆盖内皮细胞，利用微流泵把纳米颗粒以模拟血流的速度注入管道，实现了微血管系统的体外模拟。采用颗粒与细胞相互作用的方法研究纳米颗粒沉积情况，与早期在管道表面涂敷粘附因子以研究颗粒在管道中的沉积情况的方法相比7，可以更好的实现对生理状态的模拟。第一个建立人工合成的微血管网络的Jenna M. Rosano在其论文中说道，微循环系统虽然结构复杂，但实际上可以拆分为分支分叉、管径变化、弯曲转角等基本几何元素12。在本项目中，我们通过分析人和仓鼠微循环系统的造影照片，提取了转角、分叉、弯曲、管径变化等主要几何元素，分别制作微流道，这样不断简化了制作工艺，而且我们可以分析具体的几何因素对纳米颗粒与细胞相互作用的影响，并且在最后，代表不同几何元素的微流道可以整合成完整的微血管网络系统。目前，尚未有针对纳米颗粒在微血管壁细胞上的粘附及吞噬情况的体外研究先例，而该项研究确是研究纳米药物载体和成像探针到达靶点的效率、肿瘤治疗药物的EPR效应所必须的部分。用微流道系统对微血管进行模拟，不仅可以实现对复杂微血管系统的体外再造，而且该系统可以直接在显微成像系统下进行现象分析和实时检测，同时造价低廉，制作方法规范，试剂用量较宏观系统大幅度减少。微流控芯片的另一大优势就是可以实现与分析检测装置的集成。结合微流控芯片的流式细胞检测技术、免疫检测技术、微粒体分析技术，在未来，可以构建出集纳米颗粒在微流体环境下的分布模拟、相关检测技术等为一体的全方位整合的模式化芯片14。1.2研究现状分析1.2.1纳米颗粒在微血管系统中运输情况的研究研究表明，在病变组织的微循环系统中，微血管表面的内皮细胞层会发生显著变化。一个主要原因是血管内皮细胞的内皮细胞表面粘附分子（endothelial cell adhesion molecules, ECAM）的表达是可介导的15。在正常组织中，其表达量极低，而在病变部位，其表达量发生显著升高，这也是内皮细胞表面粘附分子介导的药物运输模式的理论基础16。近年来，药物设计和合成领域技术方法的不断革新，许多依托于该理论的药物颗粒载体正在被研究或者已经应用于临床，比如多聚物胶束和纳米颗粒、脂质体、DNA聚合物、病毒衣壳纳米颗粒等等。这些颗粒载体可以通过包裹、共价连接、和吸附等方式携带多种多样的治疗和造影药物15 16。载体表面携带病变部位内皮细胞发生上调表达的表面细胞因子抗体后，具有非常好的靶向运输效果，可以大幅度减少传统药物运输模式的副作用。该类药物已经在心血管疾病、肿瘤、免疫缺陷疾病等的治疗中取得可喜疗效1718 19。但是在实际实验、生产和临床应用中，该类靶向药物的运输效果却远远不及理论效果理想。而造成这一问题的主要原因就是，纳米颗粒（药物载体）与微血管系统内皮细胞层的作用机制尚未得到清除的研究结论11。随着纳米颗粒药物载体和造影剂在实验研究和临床实验中的广泛应用1 2，研究纳米颗粒在微血管系统中的运输情况和其与血管内皮细胞的相互作用情况具有重要意义。现在普遍认为，在微血管系统中，纳米颗粒先从血流主体迁移到血管壁，与血管壁细胞相互作用，穿透管壁后，才能最终到达指定的疾病和造影靶点45。纳米颗粒与管壁细胞的相互作用情况，特别是其在细胞表面的沉积及其被细胞吞噬的情况，受到多种因素的影响，主要为以下三个方面：第一，作用位点的微血管系统几何结构特征，以及其周围的血流动力学因素影响，比如剪切率，流体压力等；第二，颗粒的物理化学性质，比如尺寸，形状，密度，表面亲和力等；第三，药物载体与作用靶点的“受体配体”型生物化学相互作用的强弱4 5 11。微血管系统内皮细胞长期处于血液流体剪切力的刺激条件下。一般，微血管表面内皮细胞所受剪切率的范围是1 s-110s-1，静脉系统血管内皮细胞所受到的平均剪切率为1 s-16 s-1，动脉系统血管内皮细胞所受到的平均剪切率为10 s-170 s-120。在计算流体力学方面，世界上许多课题组已经在数值模拟和计算流体力学领域进行了广泛的研究35 36 。Liu Yaling等在其 2012发表文献中的数值模拟结果显示，纳米颗粒的尺寸越小，微流道管壁的表面剪切率越低，越是在血管分支分叉的地方，纳米颗粒越容易与微流道管壁发生粘附；纳米颗粒在分叉部分和直线部分的结合比例取决与具体的泊克莱数（Peclet Number）；棒状的纳米颗粒比球形的纳米颗粒更容易与微流道管壁结合，因为其接触面积较大，而且受到的血流拖拽力较小4。Tan Jifu等在其2012年发表文献中的数值模拟结果显示，血液中红细胞的翻滚运动可以增强纳米颗粒在血管表面内皮细胞的粘附5。但是一直缺乏可行有效的方案，通过体外实验的方法，从实验层面研究纳米颗粒在微血管系统中的分布情况。1.2.2微流控芯片技术的发展现状微流控技术（Microfluidics）开始于20世纪90年代，是一种利用微米级别的小型管道、结构，对纳升量级的微量流体进行精细控制的分析技术9，相应的技术载体即微流控芯片，如图1.121。它以微电子工艺衍生出来的软蚀刻技术为依托，通过在芯片上集成微管道、微反应室等微小元件来构建微流道系统，加载生物样品或化学反应液，以压力泵或电渗流作为动力形成微流道网络，从而在芯片上进行一种或多种精细的操作或反应，达到生物检测、化学合成、细胞培养、组织构建等多种目的10。图1.2.1 高度集成的微流控芯片照片。微流控技术的独特优点在于：样品消耗量小，效率高，调控精细，检测灵敏度高；经过在芯片上合理的集成化，还可达到高通量快速分析的目的。此外，微流控芯片因其体积小，材料易得，制作过程不复杂且日趋标准化，因而成本较低，适合商业化的生产和应用9。所谓微型全分析系统（micro-totalanalysis-system, TAS），即在一张芯片上同时完成采样、稀释、加入反应试剂、反应、分离、检测等步骤，把实验室分析的全过程芯片化，因此，微流控芯片系统也被称为“芯片上的实验室（Lab-On-A-Chip）” 922。目前，微流控芯片已被成功应用于生物、医学、物理、化学、环境科学等领域。用于制作微流控芯片的材料主要有单晶硅和高分子聚合材料两大类10，后者主要包括聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）和聚甲基丙烯酸甲脂（polymethyl-methacrylate, PMMA）。单晶硅的生产工艺成熟，但其易碎、价格昂贵，表面化学行为复杂，因此其在生物医学领域的应用较为有限。而高分子聚合材料加工成型方便，价格低廉，成为现在生物医学领域用来制作芯片实验室的主要材料。目前使用最广泛的是PDMS，它容易塑造、光学透明、化学惰性、耐用，具有生物相容性高、无毒无害、价格低廉等优点9 10。微流控芯片的制作依托于微机电系统（micro-electromechanical system, MEMS）的加工技术。不同材质的微流控芯片其制作过程亦有所不同。对于单晶硅、玻璃等硬性材料，主要利用光刻和蚀刻技术对材料本身进行直接的物理加工，从而在材料上直接获得微结构。由于微机电系统的加工工艺相对成熟，此类制作方法精度很高，可满足复杂微结构制作的要求。目前硅片上最小结构单元的尺寸已经可以达到20nm的分辨率。但是该工艺复杂，设备要求高，而且制作全过程的工作环境都局限在超净间内，不利于推广和应用。 对于高分子聚合物等柔性材料，芯片的制作方法包括软模版蚀刻法（soft- lithography）、模塑法、热压法及激光烧蚀法等相对简单的制作工艺，其中以软模版蚀刻法应用最为广泛。软模版蚀刻技术起源于微机电加工的光刻（Photolithography）和电子束蚀刻（electron-beam lithography）技术23。虽然精度并不如传统微电子工艺，但其流程简单，需时短，成本较低，对工作的大部分流程设备、环境要求不高，而且所使用的材料如PDMS也有很多传统材料所无法比拟的优点，如前文所述。基于软蚀模版刻技术的芯片制作是从芯片结构的设计开始的，将想要制作的微流道结构通过计算机辅助设计系统（Computer Assisted Design, CAD）设计出电子图纸，然后采用电子束刻蚀的方法制作金属掩膜版，或者采用激光打印机制作胶片掩膜版。金属掩膜可以多次重复使用，而胶片掩埋是一次性的。在掩膜（Mask）制作完成后，需要通过光刻技术（Photolithography）来制作硅片模板（Master）。光刻是指通过曝光和显影在光刻胶层（photoresist）上刻画几何图形结构，然后通过刻蚀工艺将光掩模上的图形转移到所衬底上的过程24。光刻技术按照所用光刻胶的不同可以分为正性光刻和负性光刻两种。正性光刻采用正性光刻胶（如BP212-37等），其被曝光部分分子交联解聚，变为可溶性物质；负性光刻采用负性光刻胶（如SU8-2050等），其被曝光部分分子发生交联固化，变为不溶性物质。光刻的具体步骤可以简述如下24：(1) 硅片清洁和脱水烘烤，除去硅片表面吸附的水分和杂质；(2) 增粘处理，在硅片表面涂一层六甲基二硅亚胺(Hexamethyldisilazane，HMDS)，增加硅片表面与光刻胶的粘附性； (3)涂胶，采用旋转涂胶法在硅片表面涂布一层均匀平整的光刻胶，胶膜的厚度取决于光刻胶本身的粘度、旋转速度和旋涂时间；(4) 前烘（软烘），除去光刻胶中的大部分溶剂，稳定其感光性；(5) 曝光（Exposure），将掩膜与衬底硅片对准，贴附在光刻胶表面，把硅片放入紫外线曝光机中进行曝光；(6) 显影（Developing），曝光后取下掩膜，将硅片放入显影液中：对于正性光胶，通过显影溶解掉曝光区域的胶膜，几乎所有的正胶都使用碱性显影液，如KOH水溶液；对于负性光刻胶，通过显影溶解掉未曝光区域，商品化的负性光刻胶都有配套的显影液，常用的有二甲苯等。显影过程中胶膜会发生膨胀，正胶的膨胀可以忽略，而负胶的膨胀则可能使图形尺寸发生变化。显影过程对温度非常敏感，可影响胶的对比度，从而影响胶的剖面形状；(7) 后烘（坚膜），使胶膜硬化，提高其在后续工序中的掩蔽性。此后，可以对该硅片模版进行硅烷化处理，这样得到的模版结构是由固定于硅片上的光刻胶形成的。也可以对该硅片进行进一步的湿法刻蚀，把光刻胶上的流道结构转移到硅片上，再去除光刻胶，这样就得到了完全在硅片上刻蚀好的微流道模版25。在模板制作好后，将PDMS单体倒于模板之上，加热固化，便可得到相应结构的PDMS沟槽。将PDMS管道揭下，经过进样口打孔等处理，再与相应的基底可逆或不可逆地嵌合，可得到芯片的成品23。图1.225以负性光刻胶例，展示了微流控芯片制作的基本流程。复杂的多层管道结构还需要运用多层光刻的工艺（套刻）。其它成型的微流控芯片大多还需要进行基底的加工和修饰、管道表面的清洁与活化、外来微元件的集成等处理。图1.2.2 基于软蚀刻技术的微流控芯片制作的部分流程。微流控技术最早的应用源于毛细管电泳，此后微流控技术在生化分离上的发展十分迅速，体现出高效、快速、耗样量少、灵敏度高等特点。Lapos等26在1.1cm的通道上，30s内可对含有4种荧光探针标记氨基酸的试样完成6次进样和分离。Effenhauser等27在长度1.3cm通道内45s完成了1025个碱基对的寡核苷酸硫代磷酸酯混合物的分离。在蛋白质结晶领域，Zheng等28利用微流控芯片控制含有蛋白样品的小液滴并使之结晶，再结合X射线衍射等方法对蛋白结晶条件进行评估。微流控芯片在分子生物学上的应用主要体现在聚合酶链式反应器（Polymerase Chain Reaction, PCR）的微型化，即微流控PCR芯片。微流控PCR芯片即将PCR的全流程，包括上样、反应（变性、退火、延伸）等，集成于同一芯片上，具有高通量、低样耗等特点。Quake小组29发明的PCR芯片每个样品的体积最少可达到3纳升。Elizabeth等30利用商用的微流控PCR芯片对环境中的多种细菌进行了高通量的多基因分析，在一片芯片上最多可同时进行14112个独立的PCR反应。图1.3就展示了一个在微流控芯片上集成的分子生物学分析范例30。图1.2.3 微流控芯片上的分子生物学分析流程范例微流控芯片不但能准确调节或迅速变换胞外环境，还可以模拟体内细胞外的三维环境，也可精细调控细胞之间的接触和物质交换13。因此，在细胞力学27、细胞迁移、细胞分化发育、细胞间相互作用等细胞生物学的研究热点，微流控芯片都有广泛应用。1.2.3微流控芯片上细胞网络的建立微流控芯片技术的另一大应用就是通过在微流道内种植细胞的方法，在芯片上模拟血管12以及其他内脏组织31。微流控芯片是体外研究微循环系统中颗粒与细胞相互作用的良好平台。一方面，微流道内微环境物理化学参数可以精确控制32，另一方面，多种多样的流体力学条件都可以在微流道内模拟33。早期的研究多在直流道内进行，不能很好地模拟人体微血管系统的卷曲、分叉、管径截面积不断变化等特点8。人工合成的微血管网络（Synthetic Microvascular Networks，SMNs）即在体外建立复杂的、具备微血管网络结构的微流道装置12，在这种网络系统中，可以更好的研究局部血管几何形状和周围微循环网络等因素对细胞与纳米颗粒的相互作用影响。2010年，Jenna M. Rosano等人利用仓鼠局部肌肉微血管系统造影图片，在制备出了模拟该微血管系统的微流控芯片，并成功将人脐静脉内皮细胞植入其中，建立了第一个可以完全再现一个活体微循环体系的人工合成微血管网络12，如图1.2.1所示。E图1.2.4 仓鼠提睾肌局部微血管微流道芯片图。图A: 仓鼠提睾肌局部微血管系统荧光图。该造影图通过局部注射FITC-葡聚糖得到。图B：通过GIS软件重建的微血管系统数字化影像再造图。图C：根据图B制作的PDMS微流道网络，用台盼蓝染色后的流道照片。图D：制作好的微流道微血管网络照片。图E：在接种内皮细胞后，局部微流道显微镜下照片。1.2.4在微流控芯片上研究颗粒运输情况的现状血管中血流动力学的刺激对于颗粒运输及其与细胞的相互作用具有重要影响，因此采用微流道研究颗粒与细胞相互作用的研究在全世界范围内得到了广泛开展6 7，采用理想化几图案的流道，研究流体流动、颗粒输运过程、受体-配体结合规律，以及颗粒与细胞相互作用这四部分之间的关系。虽然针对纳米颗粒在微流道中的运输和沉积情况的研究结果较少，但是针对尺寸在微米尺度的颗粒载体的相关研究已经取得了一定的进展。2001年，V. R. Patil等34在微流道内研究了直径分别为5m ，10m ，15m 和02m 的PSGL-1 （P选择素糖蛋白配体-1）修饰的聚苯乙烯微球的粘附情况，实验表明，该颗粒与管壁内皮细胞的粘附除了受到“受体配体”亲和力的影响外，剪切率和粒径对该过程都有重要影响。2008年，A.D. van der Meer等人在高宽长等于50 m500m2 cm 的分叉微流道内，种植了人脐静脉内皮细胞层，并研究了在不同流速下，包裹了异硫氰酸荧光素标记的非编码SiRNA（FITC-Noncoding SiRNA）的脂质体微米颗粒进入内皮细胞的情况8。如图1.2.4所示，在低流速条件和静止的条件下，进入细胞的脂质体颗粒均多余在高流速条件下进入细胞的脂质体颗粒。这可能是因为高流速条件下，脂质体颗粒与细胞作用时间不足，且流体的剪切率太高造成的。而低流速下得到比静止条件下得到更高的转染率，则很大程度上是因为在低流速下脂质体颗粒得以不断补充，因此细胞得以吞噬更多的脂质体颗粒造成的。但是该研究采用的流道宽度较宽（0.5mm），同时包裹SiRNA的脂质体颗粒也在微米级别，因此该结果应与纳米颗粒在微血管系统中的实际运输情况存在较大差异。静止状态 低流速 高流速图1.2.5 第一排：通过共聚焦显微镜（物镜为40）拍摄得到的荧光照片。细胞核被染成蓝色，荧光SiRNA显示为绿色。从左到右，分别是细胞在静止状态，低流速条件和高流速条件下，被脂质体颗粒转染的结果。第二排：荧光图片分析结果。细胞核是蓝色，绿色圆点代表发出绿色荧光的SiRNA，两者相互交叉的地方用黑色表示。每个条件下的细胞核以及绿色荧光斑点都分别计数。2010年，Nishit Doshi等人在带有分叉的微流道中研究了不同几何形状和尺寸的微米颗粒在管道分叉处的沉积情况。其研究指出，棒状颗粒相比于球形颗粒更容易与管壁发生粘附，而粒径小的颗粒比粒径大的颗粒在管壁的粘附比例更高7，如图1.2.2所示。但是该研究并未在管道表面种植内皮细胞层，因此未能真正实现对体内微血管系统中微米颗粒在管壁细胞上粘附的模拟仿真。图1.2.5 在人工合成的微血管系统中，不同剪切率条件下颗粒的几何形状对其粘附的影响。图中所示为抗牛血清白蛋白抗体修饰的微米颗粒在牛血清白蛋白修饰的微流道中的粘附情况。（a）球形颗粒（b）椭圆形棒状颗粒。在低剪切率条件下，两者之间粘附效果的差异可以很明显的从图中观察到。2008年，Balabhaskar Prabhakarpandian等人11通过把仓鼠提睾肌局部的血管造影图片用Arc-Info软件进行处理，得到数字化微流道设计图，在PDMS微流控芯片上建立了该血管网络系统，并将其内表面进行P-选择素修饰，在该系统内研究了P-选择素抗体和IgG修饰的2m聚乙烯微球在该微流道系统中的粘附情况。实验发现在，循环系统中，微米颗粒容易粘附于管道分支部位和中央的环形管道部位，如图1.2.6所示。图1.3.4：在人工合成的微血管网络系统中微米颗粒的粘附情况。图A，血管造影图；图B，微流控芯片实物图局部；图C，颗粒粘附的实验结果，图D，颗粒粘附的数值模拟图。颗粒的粘附情况是在抗P选择素抗体和IgG修饰的微米颗粒在注射进入流道10min后进行分析的。总的来说，尽管研究纳米颗粒在微血管系统内的粘附和运输情况成为纳米药物的研究热点，但是目前尚未有对于研究在体外微流道中，研究纳米尺度的载药颗粒与细胞相互作用的报道。而本项目旨在于微流道芯片上建立模拟人体内微血管系统的流道体系，从而实现体外模拟体内环境，对纳米颗粒的分散与细胞的相互作用进行研究。1.3项目研究内容（1）分析人和仓鼠微血管系统造影图，基于人体内微血管的形状及尺寸，简化变量，提取结构单元, 制作出模拟人体内微血管形状的简化微流道芯片，模拟微血管系统中常见的分支分叉、截面积突变、血管弯曲等情况, 制作硅片基板。（2）基于硅片基板，制作出PDMS微流道芯片。（3）在微流道芯片底部建立单层、连续、均匀的内皮细胞层，研究在模拟微血管系统的流道中，荧光标记的纳米颗粒在内皮细胞表面粘附和被内皮细胞吞噬的情况，对不同部位、不同剪切率条件下（如分支分叉、截面积突变等部位）的颗粒分布进行量化的分析和对比。（4）得出基于在以上情况下的纳米颗粒沉积结论，与数值计算结果相互解释。2.实验材料和方法2.1微流控芯片模版的制备 2.1.1仪器及试剂用品仪器紫外曝光机，甩胶机，加热板，烘箱（DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱）试剂及用品SU-8 2025光刻胶及其配套显影液（USA Clariant Corporation），5英寸单晶硅片（洛阳单晶硅片公司）2.1.2 AutoCAD微流道制图在分析人和仓鼠微血管网络造影图后，本文提取了微血管系统的基本几何元素：分支分叉、管径变化、弯曲和转角12，使用AutoCAD分别针对以上几何结构设计并绘制了不同的微流道设计图。各微流道的具体设计参数如图2.1.1所示，加工深度均为100m。 A BCD图2.1.1：实验所用微流道的设计图，以及各个微流道结构的具体参数。图A，模拟血管狭窄的微流道；图B，模拟血管分叉的微流道；图C，模拟血管转角的微流道；图D，模拟血管弯曲的微流道。2.1.3光刻制作微流道模版（1）基于2.1.2中的微流道设计图，采用激光照排机曝光胶片，制得胶片掩膜（深圳市美精微光电股份有限公司）。管道结构部分透明，非管道结构部分黑色不透明。（2）硅片清洗烘干：取洁净的5英寸硅片，通过湿法清洗，去离子水冲洗，脱水烘干(热板150250，12分钟，氮气保护)的步骤，除去表面的污染物(颗粒、有机物、工艺残余等)，以此除去水蒸气，使基底表面由亲水性变为疏水性，增强表面的黏附性。（3）旋转涂胶：将硅片固定于甩胶机上，通过滴加负性光刻胶SU-8 2025，加速旋转（2000rpm，60s），甩胶，挥发溶剂等一系列步骤，在硅片表面旋涂出厚度100m的光刻胶薄膜。此步制得的光刻胶层厚度均匀，表面平滑。（4）前烘（软烘），将旋涂好光刻胶的硅片放入烘箱内，温度由65升至95，并保持10分钟，去除光刻胶中的大部分溶剂，稳定光刻胶的感光特性，增强其黏附性，并防止光刻胶玷污设备。（5）对准曝光：将前烘之后的硅片放入紫外曝光机内，把掩膜与硅片对准，图形打印面朝下。用石英玻璃将其紧压于光刻胶层上，调整位置使图形位于硅片中间，固定好。打开仪器，持续曝光120s。（6）后烘：将曝光过的硅片取下，摘掉胶片掩膜，将硅片放入烘箱内，温度由65升至95，并保持10分钟。（7）显影：将硅片放入显影液中，洗去没有反应的光刻胶，反复冲洗干净后，用氮气吹干。未洗去的光刻胶即呈现所设计的结构，突起于硅片上，形成模板。经过硅烷化处理后，模版可在较长的一段时间内反复使用。本实验用的光刻胶SU8-2025为负性光刻胶，通过显影溶解掉未曝光区的胶膜。显影过程对温度非常敏感，可影响胶的对比度，从而影响胶的剖面形状，所以在实验过程中要尽