模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响

单位代码 10006 学 号 10101019 1分类号 Q786 毕业设计(论文)模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名桂金鹏 指导教师郑丽沙 2014 年 6月 论文封面书脊模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响 桂金鹏 北京航空航天大学桂金鹏 北京航空航天大学 北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 本实验中使用的图片，主要有凝胶电泳图和成骨细胞的鉴定图，根据实验结果，由凝胶成像仪和倒置显微镜拍摄生成。其他数据有PCR结果、Real Time-PCR结果和Western Blotting结果经作图软件绘制，并经统计学分析而得。 本实验涉及的实验技术有：细胞原代培养和传代培养技术，成骨细胞鉴定技术，RNA和蛋白提取技术，RT-PCR技术，Real Time-PCR技术，Western Blotting技术。同时，还涉及PCR和Western Blotting图像处理分析技术以及统计学分析技术。 、毕业设计（论文）工作内容： 1月20日-3月02日 文献调研 3月02日-3月15日 大鼠成骨细胞原代培养 3月15日-3月20日 成骨细胞鉴定 3月20日-4月30日 加载模拟微重力效应 4月 01日-4月20日 研究基因水平情况，PCR以及Real Time- PCR 4月20日-5月10日 蛋白水平检测Western Blotting 5月10日-6月05日 数据分析处理，完成毕业论文书写，准备答辩 、主要参考资料：1 沈羡云.21世纪失重生理学研究的展望J.航天医学与医学工程.2003,16:573-576. 2 孙联文，庄逢源.微重力导致航天员骨质疏松的研究进展J.中华航空航天医学杂志.2004,15(1):54-58. 3 Harada, S and G.A. Rodan. Control of osteoblast function and regulation of bone mass J .Nature. 2003,423:349355. 4 Joachim Albers, Jochen Schulze, F. Timo Beil, et al. Control of bone formation by the serpentine receptor Frizzled-9J. J Cell Biol.2011,192(6):1057-1072. 5 Strutt D. Frizzled signaling and cell polarization in Drosophila and vertebrates J. Development,2003,130(19):4501-4513. 6 Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM. Wnt signaling in osteoblasts and bone diseases J.Gene,2004,341:19-39. 7 李林. Wnt信号通路及其与骨形成的关系J. 临床和实验医学杂志. 2010 ,9(20):1580-1584. 8 Kajstura J, Cheng W, Reiss K, et al.Apoptotic and necmtic myocytecell deaths are independent contributing variables of infarct size in ratsJ.Lab Invest,1996,74(1):86-107. 9 Qin F, Liang MC, Liang CS. Progressive left ventricular remodeling myocyte apoptosis and protein signaling cascades after myocardial Infarction in rabbitsJ. Biochim Biophys Acta.2005,1740(3):499-513. 10 钱红波，赵建宁.LRP5：调控骨密度的新基因J.中国骨质疏松杂志.2005,11(4):538-540. 11 Babij P, Zhao W, Small C, et al.High bone mass in mice.expressing a mutant LRP5 geneJ. J Bone Miner Res,2003,18(6):960-974. 12 Little, R.D.et al. A mutation in the LDL receptor-related protein 5 gene results in the autosomal dominant high-bone-mass traitJ. Am. J. Hum. Genet,2002,70:11-19. 生物与医学工程学院 学院 生物工程 专业类 101011 班学生 桂金鹏 毕业设计（论文）时间： 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 06 月 1 日答辩时间： 年 月 日成 绩： 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字）： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 2 页 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 1 页 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：桂金鹏签字：时间：2014年6月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 IV 页 模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响 学 生：桂金鹏 指导教师：郑丽沙摘 要长时间的太空飞行由于人体处于微重力环境，会导致宇航员出现严重的骨丢失现象，成骨细胞骨形成作用的减少是骨丢失的一个重要原因。成骨细胞中Wnt信号通路是调控骨形成的一个非常重要的信号通路，而Fzd9是存在于细胞膜上的Wnt蛋白的重要受体蛋白。在成骨诱导分化早期，所有Fzd成员中仅有Fzd9表达上升。敲除Fzd9基因的小鼠会表现出明显的低骨量，显示出Fzd9在成骨骨形成方面的重要调控作用，但在微重力导致的骨丢失中Fzd9起到什么作用还是未知的。本项目利用原代培养的大鼠成骨细胞，以单轴回转器对细胞加载模拟微重力效应，利用RT-PCR、Real Time-PCR和Western blotting等方法，研究了成骨细胞中Fzd9基因水平和蛋白水平的表达变化情况，发现随着加载模拟微重力效应的时间增加，Fzd9的相对表达量在基因水平和蛋白水平均有显著性的降低。我们还发现成骨细胞ALP的活力随着加载时间的延长而降低，表明其成骨能力也降低了，与Fzd9的表达量降低相一致，由此我们的实验结果证实了Fzd9在微重力引起的骨丢失中可能存在着重要调控作用，为探索微重力环境骨丢失机制打下基础。关键词：模拟微重力效应，成骨细胞，骨丢失，Fzd9Effects of simulated microgravity on expression of Fzd9 in rat osteoblastsAuthor : GUI Jin-peng Tutor : ZHENG Li-shaAbstractAstronauts often display a bone-loss phenotype because the microgravity environment after a long-term space flight，and reduction of osteoblast bone formation is an important cause of bone loss. Wnt signaling pathway in osteoblasts is of critical importance for the regulation of bone formation, and Fzd9, the membrane receptor of wnt protein, plays a great role. Of all Fzd members, only Fzd9 is induced upon osteoblast differentiation and Fzd9-/- mice display significant low bone mass caused by impaired bone formation, showing an important role in the regulation of bone formation. However, what role does Fzd9 play in the regulation of bone loss caused by microgravity remains unknown. In our project, a uniaxial gyrator was employed to expose primary rat osteoblasts to simulated microgravity ,then we took RT-PCR ,Real Time-PCR and Western blotting experiments to study the expression tendency of osteoblast Fzd9 in transcription and translation levels .We found that the expression of Fzd9 were significantly reduced with loading time increasing. Consistent with the decreasing expression of Fzd9, We also found that the ALP activity of osteoblasts was reduced with load time expanding. Thus, our experimental results confirm Fzd9s possible role in bone loss caused by microgravity, and lay the foundation to explore the mechanism of bone loss in microgravity environment .Key words：simulated microgravity, osteoblast, bone loss, Fzd9目 录1绪论11.1课题背景11.2国内外研究现状22实验方案设计82.1实验目的82.2实验方案设计及论证83实验材料133.1动物材料133.2主要试剂133.3主要设备143.4主要试剂配制153.5引物164实验方法174.1细胞培养174.2成骨细胞的鉴定184.3加载模拟微重力效应194.4成骨能力的检测194.5基因水平的检测204.6蛋白水平的检测235数据处理275.1RT-PCR图片处理275.2Real Time-PCR图片处理295.3BCA法中蛋白浓度的计算305.4ALP活力的计算305.5Western blotting图片处理316结果及分析326.1成骨细胞形态的变化326.2成骨细胞的鉴定336.3加载模拟微重力后细胞成骨能力的变化336.4RT-PCR结果346.5Real Time-PCR结果356.6Western blotting结果367讨论37结论39致谢40参考文献41北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 44 页 1 绪论1.1 课题背景随着航天技术的发展，人类成功实现了进入太空的梦想。但随着进入太空的航天员越来越多，承担的飞行任务越来越中，停留在太空的时间越来越长，人们发现太空飞行由于人体处于微重力环境，会给宇航员的身体带来很多不利的影响，表现在运动系统、心血管系统、免疫系统等的生理异常1，如骨丢失、免疫力下降、肌肉萎缩等等。其中，微重力对骨的影响尤其显著。微重力会使得骨出现骨密度下降、骨矿盐丢失、钙磷代谢失衡等，容易出现骨质疏松现象1-2。通过卧床实验以及太空飞行的记录发现，平均每月骨骼的(12)%被动员并丢失；如果每天体育锻炼23h，骨钙还是以每月0.4%的速率丢失3。经过59天、84天的空间飞行，航天员的跟骨骨矿密度分别下降了4和8，飞行140天甚至会下降194。微重力引起的骨丢失现象已成为一个不可忽视的问题，制约着航天事业的发展。骨是不断地进行着重建的，骨重建过程分为两部分，首先破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。骨形成与骨吸收的平衡是维持正常骨量的关键5。如果成骨细胞骨形成作用大于破骨细胞骨吸收作用就会表现为骨量增加，反之就会表现为骨量减少。严重的骨量减少就会导致骨质疏松。而微重力导致的骨丢失现象与成骨细胞和破骨细胞的活动密切相关，所以阐明调节这两种细胞分化和活动的分子机制对预防和治疗骨丢失具有重要的意义。在微重力条件下，在骨重建区域内破骨细胞数量增多、其活性增加，功能活跃的破骨细胞数量比例增加，显示微重力对破骨细胞的功能和增殖是促进作用的6。对成骨细胞的研究相对要多一些，研究显示，微重力条件下，成骨细胞生长速度明显减缓，细胞数量显著降低，且其形态发生一定变化，如细胞核缩小、张力纤维数量减少等。白细胞介素、骨钙素等细胞因子的分泌也受到一定的抑制。除此之外，微重力还会诱导成骨细胞的凋亡，抑制成骨细胞的分化6。显示出微重力对成骨细胞的增殖、分化和成骨功能具有抑制作用。对微重力下成骨细胞的研究已经涉及到信号通路了。研究发现，微重力下成骨细胞中与成骨细胞凋亡相关的51-PI3K-Bcl-2通路下调，MAPK信号通路也受其影响6。除此之外，研究表明，Wnt信号通路也参与成骨细胞骨形成过程的调控。目前，大量文献对Wnt通路这方面的调控进行了研究，证实了Wnt蛋白、Lrp5、-catenin等Wnt通路组成分子都参与到了骨重建调节中。但是，作为Wnt蛋白重要的膜受体，Frizzled蛋白的作用还远未阐明。Joachim Albers等人7的研究证实了Fzd9在骨形成调控中具有重要作用，我们以研究模拟微重力效应对大鼠成骨细胞Fzd9表达的影响为切入点，研究Fzd9参与成骨细胞骨形成调控的分子机制。通过我们对微重力条件下，成骨细胞中Fzd9的基因和蛋白水平上的变化的研究，将提示模拟微重力效应下成骨细胞骨形成过程中Fzd9受体在Wnt信号通路中的可能作用，对人们理解微重力条件下成骨细胞中Wnt信号通路的调控具有重要作用。作为一个重要的膜受体，一旦揭示了Fzd9在成骨细胞骨形成调控中的作用，就可能以Fzd9或者与之相关的分子作为药物的靶标，开发出预防和治疗骨质疏松以及微重力引起的骨丢失的药物和方法，促进载人航天事业的发展，为广大骨质疏松患者带来福音。1.2 国内外研究现状目前Wnt信号通路是对骨重建调节作用机制的研究的一个热点。Wnt信号通路是一条高度保守的信号通路，从果蝇到高等哺乳动物，其成员具有高度同源性。目前研究发现最少有三条信号通路是以Wnt蛋白为激活信号的，它们分别是：Wnt/-catenin、Wnt/Ca2+和Wnt/平面细胞极性（PCP）信号转导通路等8。其中Wnt/-catenin经典途径研究最为透彻的一条9。其主要组分包括：细胞外因子（Wnt）、跨膜受体（Lrp5/6和Fzd）、胞质蛋白（-catenin）以及核内转录因子（TCFS/LEF），大致的调节过程如下：当跨膜受体Lrp5/6和Fzd没有被Wnt蛋白激活时，胞质中Axin/GSK-3/APC复合体处于稳定状态，复合体中的CK1、GSK3分别使得-catenin N 端的一些高度保守的 Ser/Thr 残基磷酸化，从而被E3 泛素连接酶复合物-TrCP识别，并迅速的被蛋白酶体当成靶点给降解掉，使得胞质中的-catenin的浓度维持在较低水平。当细胞外因子Wnt与跨膜受体Lrp5/6和Fzd结合后，引起受体的磷酸化，磷酸化的受体Fzd作用于胞质内的蓬乱蛋白（Dsh），Dsh能使APC复合体分解，从而切断-catenin的降解途径，抑制-catenin的降解和磷酸化，使得-catenin在细胞内积累，-catenin就可以进入核内，取代了转录抑制因子的位置，使得核内转录因子TCF/LEF功能被激活，启动靶基因的转录和表达，调节细胞的生长和分化等生命活动10-11。而非经典的Wnt/Ca2+信号通路可以激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC），Wnt/PCP信号通路可以激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，使细胞结构发生重组，达到调控的目的12。图1. 1 经典Wnt信号通路12目前有很多研究表明，Wnt信号对于成骨细胞的骨重建过程起到重要的调控作用。到目前为止，已经发现了超过20种Wnt蛋白家族成员，人类有其中的16种12。Wnt被分为两大类：第一类包括Wnt1，Wnt2，Wnt3，Wnt3a，Wnt8和Wnt8b，它们能够与膜受体Lrp和Fzd相互作用，激活经典Wnt/-catenin信号途径；另一类包括：Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a和Wnt11，它们与Fzd相互作用，激活异源三聚体G蛋白，提高胞质内Ca2+浓度或激活Rho依赖性的细胞骨架变化13。Wnt能直接影响多潜能前体细胞的成骨细胞相分化过程，如在C3H10T1/2细胞系中稳定表达Wnt1、Wnt3a、Wnt6和Wnt7b能促进其增殖，Wnt1、Wnt2和Wnt3a能够诱导碱性磷酸酶的活性，说明Wnts可以促进前体成骨细胞的增殖，并促进成骨细胞早期阶段的分化14-16。Wnt蛋白对成骨细胞分化的作用还表现为促进前体细胞的定向分化，抑制其他类型的分化，C3H10T1/2细胞系中过表达Wnt3a会抑制PPARy2的表达，而PPARy2是脂肪细胞的标志物。Wnt1和Wnt10a也能抑制脂肪细胞或脂肪前体细胞的分化17。Wnt蛋白也具有抗凋亡的作用，Maria等18发现Wnt3a、Wnt5a等能够在一定程度上抑制C2C12、OB-6和MC3T3-E1等成骨细胞的凋亡，并且是通过一种非经典的Wnt途径。以上研究证实了Wnt信号通路对于骨量调控、骨形成作用是具有调控作用的。低脂密度蛋白Lrp5/Lrp6与Fzd蛋白共同组成了Wnt的膜受体。研究表明，Lrp5功能缺失突变表现为因骨形成降低而造成的骨量下降19。Lrp5-/-动物模型中成骨细胞的数量下降，骨形成作用降低了50%17，说明成骨细胞增殖和分化同时被抑制。在Lrp5功能获得性突变小鼠中，产生了大量具有功能性的成骨细胞，且ALP的表达以及矿化能力也加强了20，显示出Lrp5对成骨细胞分化有促进作用。人体 LRP5 基因灭活突变会导致骨质疏松-假神经胶质瘤综合征，活化突变则会导致骨硬化病21。对比Lrp5和Lrp6的氨基酸序列，发现两者有70%是一样的，Lrp6在骨组织发育中，同样会介导Wnt信号向胞质内的传递。Lrp6-/-小鼠处于胚胎期时就会致死，表型与Wnt缺失模型类似，Lrp6+/-小鼠相比于同龄鼠，总体骨密度也会下降，说明Lrp6在骨形成过程中也有重要的作用19-22。-catenin是经典的Wnt信号通路中一个非常重要的分子，它是介导Wnt信号从膜外到胞浆再进核内传递的一个枢纽分子。成骨细胞中广泛表达-catenin，能够促进成骨细胞的分化。Bain等23发现,C3H10T1/2细胞系中-catenin功能获得性突变，可以改变细胞的形态和培养密度，同时可以使得细胞ALP的活性更高。在已分化的成骨细胞中稳定表达-catenin可造成骨量增加，反之可造成骨量减少。间充质干细胞中灭活-catenin会引起成骨分化受阻和骨形成障碍24-26，表明经典 Wnt 信号通路是成骨细胞分化所需的。在成熟的成骨细胞或分化晚期的骨细胞中灭活-catenin会导致低骨量，而低骨量并不是由骨形成减少引起的，而是骨吸收被激活27-29，暗示着经典的Wnt信号通路并不直接调控成骨细胞的骨形成作用，而是调控破骨细胞的骨吸收作用。之后的研究证实了该推测，经典Wnt信号通路能影响基因 Tnfrsf11b的表达，Tnfrsf11b编码的骨保护素，是一种抑制破骨细胞生成的细胞因子27。说明经典Wnt信号通路只是影响成骨细胞的分化和增殖，不会影响骨形成能力，这也暗示着非经典的Wnt信号通路在骨形成作用中扮演着重要作用。非经典的Wnt通路是独立于-catenin的Wnt通路，至少有Wnt/Ca2+和Wnt/平面细胞极性（PCP）信号转导通路这两条途径。Wnt/PCP通路的组成分子主要是三种跨膜蛋白Fzd、Flamingo(Stan或Fmi)、Strabismus(Stbm或Vang)以及与膜分子相互作用的胞内蛋白Dishevelled(Dsh)、Diego(Dgo)和Prickle(Pk)。Wnt/PCP信号通路的主要途径是：Wnt蛋白(Wnt5，Wntll等)与跨膜蛋白Fzd结合，在Vang、Dgo、Pk的调节下募集胞内分子Dsh，使之被激活，然后激活鸟苷三磷酸酶Rac、RhoA和cdc42，RhoA激活下游的Rho激酶(ROCK)、Rac激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白激酶C(PKC)，引起核内的一些转录因子如ATF2、DPC4等的活化，调控靶基因的转录效率发生变化，进而调控细胞的运动、黏附和极化30。图1. 2 Wnt/PCP信号通路30Wnt/ Ca2+信号通路的组成成分是磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC）。过程如下：Wnt蛋白（Wnt4、Wnt5a、Wnt11等）与相应的Fzd受体结合，可以激活胞内的G蛋白，比如受体Fzd2可以激活G蛋白亚型Go和Gt2，再进一步激活PLC，被活化的PLC可以使膜磷脂水解，产生第二信使分子三磷酸肌醇（IP3）和二脂酰甘油（DAG）。DAG可以活化PKC，IP3则促进内质网释放Ca2+，细胞内Ca2+浓度的增加也反过来可以激活PKC以及Ca2+依赖的蛋白激酶(CaMK II）。PKC作用于整合素、Fascin、Adducin、Vinculin、AFAP-110、ERM等细胞骨架蛋白，调节细胞的移行运动和黏附能力31。图1. 3 Wnt/Ca2+信号通路31研究证实了这些非经典的Wnt通路在细胞增殖、分化等生命活动中发挥了重要作用，关于骨形成方面，非经典的Wnt通路也具有调节作用。Xiaolin Tu等人32研究发现在ST2细胞中，Wnt3a信号分子能够通过G蛋白的Gq/11亚基激活磷脂酰肌醇信号和PKC，而Wnt3a诱导的成骨细胞生成需要Gq/11-PKC通路的参与。小鼠成骨细胞Wnt7b基因敲除会导致低骨量现象，而研究发现Wnt7b调控成骨骨形成过程也是通过Gq/11-PKC通路实现的。Koshiro等33发现，IL-1能够诱导人间充质干细胞分化为成骨细胞并促进基质矿化，而深入探究发现，该过程是通过Wnt5a/Ror2这一非经典的Wnt通路实现的，并推测IL-1Wnt5a/Ror2JNKRUNX2的调控途径。Roland等34发现Wnt5a/Ror2/ JNK信号通路能够促进RANKL诱导的破骨细胞生成，从而使得骨质丢失。但更加具体可信的骨丢失中非经典Wnt通路机制还有待研究。关于Frizzled蛋白的研究为我们提供了一种思路。Frizzled家族(Fzd)是存在于细胞膜上的一类7次跨膜蛋白，含有一段半胱氨酸富集结构域（CRD）的胞外区，能通过该区与Wnt蛋白结合，将Wnt信号传递到胞内35。到目前为止，已经发现了Fzd1-10在内的十个成员，10个成员具有多种多样的调控功能，分别参与经典和非经典的Wnt途径35。有研究指出，无论哪种Wnt信号通路，都需要Wnt配体与对应的Fzd受体结合，才能激活整个信号通路，发挥生物学效应35。从这个角度出发，可以推断出Fzd一定会参与成骨细胞骨形成的调控，从Fzd为突破点就很有可能找到正确的调控途径。关于Fzd在骨形成方面的研究还比较稀少，有研究指出，成骨细胞中Fzd产物的产生是作为Wnt信号的一种反馈机制受Wnt信号的调控的36。在人的四种骨细胞中，有三种骨细胞检测到FZD1，2，4，5，7，8和9的表达，FZD3只在一种细胞中表达，而FZD6和10不表达37。在野生型和Lrp5-/-小鼠颅骨原代成骨细胞中检测到了Fzd2和6的转录，在矿化诱导培养基中培养10天会使得它们的转录水平下降，暗示着在成骨细胞分化时期，有几种Wnt蛋白的表达下调38。在间充质细胞（C2C12，C3H10T1/2和ST2）中BMP2（诱导成骨分化的细胞因子）会诱导Fzd1的表达，而在COS细胞中过表达Fzd1却会抑制BMP2和Wnt3a诱导的ALP生成39。Joachim Albers等发现，在成骨诱导分化早期，所有Fzd成员中仅有Fzd9表达上升。Fzd9-/-细胞成骨向诱导后矿化能力大大降低，Fzd9-/-小鼠由于骨形成障碍而导致明显的低骨量7，显示出Fzd9对于成骨细胞的骨形成作用具有十分重要的调控作用。他们还发现Fzd9-/-成骨细胞中Wnt5a对Erk1/2和Akt的磷酸化激活受阻，这很有可能就是Fzd9参与骨形成的一个途径。Fzd9还会与Wnt2相互作用，参与293T细胞中Wnt信号的调控40。这些报导都只是指出了Fzd9可能参与成骨细胞骨形成的可能途径，而具体机制还是不明。本项目拟研究模拟微重力效应下成骨细胞中Fzd9的表达变化，为探索微重力环境骨丢失机制打下基础。通过我们对微重力条件下，成骨细胞中Fzd9的基因和蛋白水平上的变化的研究，将提示模拟微重力效应下成骨细胞骨形成过程中Fzd9受体在Wnt信号通路中的可能作用，对人们理解微重力条件下成骨细胞中Wnt信号通路的调控具有重要作用。2 实验方案设计2.1 实验目的通过单轴回转器模拟微重力效应，采用RT-PCR、Western blotting等方法，研究模拟微重力效应下，大鼠成骨细胞中Fzd9基因水平和蛋白水平上的变化情况，为研究相关的分子机制奠定基础。2.2 实验方案设计及论证本项目首先进行SD大鼠成骨细胞的原代培养，并进行成骨细胞的鉴定。进而对培养的成骨细胞加载模拟微重力效应，在不同时间段收取样品，从基因水平和蛋白水平研究Fzd9的表达情况，并检验其成骨活性的变化情况。2.2.1 原代培养成骨细胞的原代培养方法已经比较成熟了。目前比较常用的是酶消化法和组织块法。酶消化法是在分离成骨细胞时加入胰酶、胶原酶、透明胶质酶等酶，降解胶原纤维，从而释放出成骨细胞。该方法操作简单，可以获得大量的细胞，易于满足实验需求，但掌握好酶的用量及消化时间较为困难，从而会使得细胞出现一定损伤。组织块法就是使得分理出的骨块紧贴培养皿（或其他容器）一段时间，成骨细胞自行从骨块中爬出。培养组织块法操作简单、技术完善，对细胞的损伤小，但该方法获取的成骨细胞数量较少，不能短期内获取大量的细胞。最初，考虑到时间关系，我们决定采用短期内就能获取大量细胞的酶消化法，但是，实验中我们发现，酶消化法的操作更为复杂一些，并且很难掌握好酶的种类、酶的用量、消化的时间等，我们首次的原代培养以失败而告终。之后我们用组织块法进行培养时，发现操作非常简单，获取的细胞量并不是非常少，能够满足实验的需要，并且细胞的状态也非常不错。所以我们选择了组织块法作为我们原代培养的实验方法。组织块法常用的实验材料有扁骨、松质骨、颅骨等，其中颅骨的获取比较方便。相较于其他的骨，用颅骨为实验材料，可以获取更为纯净的成骨细胞。出生24小时之内的SD大鼠头皮很薄，几乎没有毛发，易于剔除，且颅骨非常薄，还是软的，非常容易取，进行原代培养，非常适合。所以我们决定以SD大鼠乳鼠的颅骨为实验材料，以组织块法为实验方法进行成骨细胞原代培养。虽然用颅骨进行组织块法获得的成骨细胞较为纯净，但是，其中还是夹杂着很多杂细胞，最多的是成纤维细胞。所以要想使得成骨细胞的纯度达到实验的需求，还需要进行成骨细胞的纯化。细胞纯化的方法有很多，如密度梯度离心、酶消化法、细胞因子依赖纯化法、机械刮除法、反复贴壁法和电烙筛选法等，其中比较简单，又适用于成骨细胞和成纤维细胞的是反复贴壁法，当细胞处于悬浮状态时，大部分成纤维细胞能在10-30min内完成贴壁过程，而成骨细胞短时间内不能贴壁或贴壁不稳定，稍加震荡就会浮起，所以利用反复的贴壁就可以去除相当一部分的成纤维细胞。2.2.2 成骨细胞鉴定鉴定成骨细胞具有以下生物学特性：富含碱性磷酸酶，大量合成骨基质成分，少量型胶原而多型胶原，形成矿化结节等41，这些生物特性都可以作为成骨细胞鉴定的一个重要方面，其中碱性磷酸酶染色最为常见。成骨细胞能够合成分泌碱性磷酸酶，被认为是成骨细胞分化早期的标志，在功能活跃的成骨细胞内碱性磷酸酶组化染色阳性，因此检测碱性磷酸酶成为了鉴定成骨细胞的一个重要的方法。常用的碱性磷酸酶染色方法有：偶氮偶联法和Gomori钙钴法，经偶氮偶联法染色后，胞浆中有许多红色颗粒。经Gomori钙钴法染色后，胞浆中有许多染成灰黑色颗粒或块状沉淀。由于实验室中有现成的做钙钴法的药品，并且该方法相对偶氮偶联法而言更为简便，所以我们的首选钙钴法鉴定成骨细胞。同时，由于指导老师有碱性磷酸酶的抗体，所以免疫组化染色也是我们的一个选择。但是，随着我们实验的进行，我们发现抗体的效价降低了，染色结果不明显，所以我们最后只采取钙钴法。染色时机的选择也是一个非常重要的方面。因为成骨细胞代数过早，含有的杂细胞过多，结果不理想。一般细胞到了第三代或第四代时，细胞纯度就比较高了，并且细胞的生物特性还是比较接近于体内的，是做鉴定的最好时期。细胞经过传代后，细胞的活性还是会有一定的损伤，其碱性磷酸酶的合成分泌量较少，此时染色，结果几乎看不出来，当培养4天以上再进行染色时，结果就很明显了，所以染色的最好时期就是第三代（或第四代）细胞培养4天以上。2.2.3 加载模拟微重力效应在太空飞行时，不与质心重合的物体，所受引力不同于质心处，会产生一个相对于质心的加速度；同时，大气的阻力、航天器的推力、航天器转动、内部设备和人员的运动等多种外力的合力，也会产生一个相对于质心的加速度。这些相对于质心的加速度的和的大小相对于地面的重力加速度而言，通常都是非常小的，这些加速度或单位质量物体受到的合力称为“微重力”42。一般这些加速度不超过g的10-410-5。在地面上模拟微重力效应的方法有很多，最理想的是自由落体，如落塔、落管、自由下落机等，但该类方法模拟微重力时间短，处于高速运动，成本高，不利于重复，所以不太适合做生物实验。其次可借助某种设备或仪器在某种程度上模拟微重力的效应，地面模拟微重力效应的方法常见的主要有回转器、动物模型、人模型三种。回转器是一种使受试验的生物样品围绕一个或几个轴进行旋转的设备，是一种在地面模拟微重力生物学效应的简便、廉价方法。回转器模拟微重力效应的原理是在一定的转速下，实验样品相对于重力的方向不断被改变，样品对重力的响应时间大于重力相对方向的改变时间，使得样品还未感觉到重力，重力方向就已经改变了，相当于样品未受到重力一样。回转器模拟微重力效应是目前比较流行的实验方法，被很多文献证明是有效的。由于学院实验室拥有单轴回转器，所以我们完全决定学院的单轴回转器模拟微重力效应。利用单轴回转器模拟微重力效应的关键是转速的设定、加载时间的设定。我们查阅文献发现，很多研究人员将转速设定为15 30 r/min，可以模拟微重力效应，实验证明确实是有效的。在陈曦42的论文中有理论计算公式，我们按照论文中的方法经过计算，发现1530r/min是可以起到模拟微重力效应的，由于转速过高时，细胞有可能会被剪切力给从瓶底冲刷下来，所以我们选择了较低的转速15r/min。对于加载时间的设定，我们发现加载时间不宜过短，也不宜过长。细胞产生生物效应需要一定时间的积累，加载时间过短，一般几小时到一天，检测不到细胞效应的显著变化。加载时间过长，一般一周左右以上，增加了染菌的可能，且培养液中的营养成分被消耗，影响细胞的代谢和实验结果的准确性。我们选择了一个适当的时间，分别在加载的第一天、第二天和第三天收集样品，可以观察到显著的变化。2.2.4 成骨活性的检测本项目研究的主要侧重点是研究Fzd9与成骨细胞骨形成之间的关系，在上述实验方案中是利用模拟微重力效应的方法制造一种骨量较少、骨丢失加剧的条件，所以，对于已经加载的细胞样品，有必要检测细胞的成骨能力的变化情况，检测我们的实验方案是否对成骨细胞成骨能力有影响。ALP的活性是表征成骨细胞骨形成能力的一个重要指标，所以检测细胞ALP活性的变化情况是可以达到我们所需的目的的。实验室拥有检测ALP活性的试剂盒，能够满足实验的需求。2.2.5 基因水平的检测从基因水平研究Fzd9的表达情况，RT-PCR是最为常见实验方案，具有灵敏度高、简便快速、纯度要求低等优点。我们从Joachim Albers等7的文献中找到了可以用于实验的Fzd9和GAPDH的引物序列和实验方案，我们验证了引物和实验方案的可行性，结果良好。所以RT-PCR实验是我们的首要实验方案。但是，RT-PCR实验是对PCR结束后的终点产物进行定量分析，实验过程中各种操作的不精准、PCR程序中的不准确等系统误差都会积累在最终的实验结果中，使得RT-PCR的结果存在非常大的偶然性。还有研究指出用相同的模板进行96次扩增，终点处产物量差别非常大。所以，为了更加准确反映Fzd9基因表达的变化情况，使我们的结果更有说服力，我们决定采用更加精确的实时荧光定量PCR（Real Time-PCR）。实时荧光定量PCR就是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。不同于RT-PCR对终点产物进行定量，Real Time-PCR是在扩增阶段的对数期对起始模板进行定量，大大减少了各种误差的积累，具有灵敏度高、使用方便、价格便宜以及对DNA模板没有选择性等优点。目前该方法在国际上有很高的接受度，作为RT-PCR的补充非常具说服力。2.2.6 蛋白水平的检测检测蛋白表达的方法有很多种，如免疫印迹法（Western blotting）、免疫组化法、酶联免疫吸附试验（Elisa）等，其中免疫组化是通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)，主要实验材料是组织切片。Elisa原理类似于免疫组化，但待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，不会用到组织包埋、切片等技术，Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高，但价格也非常昂贵。Western blotting其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，实验材料多是组织细胞，可以检测胞内蛋白，其灵敏度没有Elisa高，一般用于半定量分析。本项目实验目的是检测Fzd9蛋白表达量的变化情况，属于半定量的范畴，故Western blotting是首要选择。目前实验室恰好有Fzd9和GAPDH的抗体和对应的二抗，能够满足实验的需求。3 实验材料3.1 动物材料出生不足24h的SD大鼠乳鼠从北京大学医学部动物房购买。3.2 主要试剂DMEM干粉Gibco公司小牛血清天津康源生物技术有限公司胰酶干粉美国Amresco公司DMSO北京化工厂Trizol试剂Life Technologies公司氯仿北京化工厂异丙醇北京化工厂乙醇北京化工厂dNTP MixTaKaRa公司Random PrimerTaKaRa公司M-MulvTaKaRa公司RRITaKaRa公司rTaqTaKaRa公司溴化乙锭生工生物DNA MakerTaKaRa公司琼脂糖粉末Biowest公司2SYBRTaKaRa公司TEMEDKH公司ALP试剂盒南京建成科技有限公司钙钴法试剂盒南京建成科技有限公司Western blotting发光液北京普利莱基因技术有限公司BCA法试剂盒Beyotime公司PMSFBeyotime公司兔抗GAPDH抗体杭州贤至生物技术有限公司山羊抗Fzd9抗体杭州贤至生物技术有限公司兔抗山羊IgG/辣根酶标记抗体中杉金桥山羊抗兔IgG/辣根酶标记抗体中杉金桥3.3 主要设备洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司倒置相差显微镜日本Olympus公司恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司CO2培养箱美国Thermo公司-80超低温冰箱美国Thermo公司冰箱青岛海尔集团单轴回转器美国Wheaton公司高压灭菌器日本ALP公司电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司低速离心机德国Hermle公司低温高速离心机德国eppendorf公司PCR仪德国eppendorf公司荧光定量PCR仪美国Bio-Rad公司酶标仪美国Therm