成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活的基因筛选

单位代码 10006 学 号 10101017 分 类 号 Q476 成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活的基因筛选2014年 6月毕业设计（论文）成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活的基因筛选 高凯瑜 北京航空航天大学北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活的基因筛选 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 确保原始资料真实，不违背学术要求。在本实验中大部分实验原始数据为荧光显微镜照片。 本实验中涉及到的实验技术有：线虫养殖，抑制线虫繁殖，线虫周期同步化，RNA抑制技术，荧光显微镜及荧光体视镜的使用等。 、毕业设计（论文）工作内容：2月20日3月10日重复先前报道中的实验，摸索，确定，细化实验条件。 3月11日4月1日探究线虫在发育过程中线粒体未折叠蛋白质反应失活的具体发育阶段和时间。 4月2日5月3日利用RNAi（约1100个基因）的技术筛选线粒体未折叠蛋白质反应失活相关的基因。 5月4日5月20日对筛选到的基因进行初步分析。 5月21日6月9日书写毕设论文，准备答辩。 、主要参考资料：1Liu Y, Samuel B S, Breen P C, et al. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondriaJ. Nature, 2014.2Durieux J, Wolff S, Dillin A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevityJ. Cell, 2011,144(1):79-91.3Dillin A, Hsu A, Arantes-Oliveira N, et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during developmentJ. Science, 2002,298(5602):2398-2401.4Nargund A M, Pellegrino M W, Fiorese C J, et al. Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activationJ. Science, 2012,337(6094):587-590. 生物与医学工程学院 院（系） 生物工程 专业类 1010111 班学生 高凯瑜 毕业设计（论文）时间： 自 年 月 日至 年 月 日答辩时间： 年 月 日 成绩 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 教研室主任 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：高凯瑜 签字： 时间：2014年 6 月北京航空航天大学毕业设计（论文） 第 58 页成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活的基因筛选学 生：高凯瑜 指导老师：刘 颖、郑丽沙摘 要线粒体未折叠蛋白质反应是近年来才被关注的线粒体修复反应，对于线粒体功能的维持具有重要作用，但是其具体特性和机制并不清楚，其中有一个非常有意思的现象是成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应会失活。本文发现线粒体未折叠蛋白质反应不能被内质网抑制剂激活，内质网未折叠蛋白质反应也不能被线粒体抑制剂激活。本文确定了RNAi（atp-2，spg-7）及抗霉素A不能诱导线粒体未折叠蛋白质反应的时期分别在线虫L4时期和成虫第六天。并利用RNAi基因筛选的方法对spg-7 RNAi诱导线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活进行了研究。对转录因子，激酶和神经肽三个文库约1036个基因筛选，找到了zip-1和mbk-2两个基因。除此之外，还发现了一些出乎意料的现象：1）不同浓度的抗霉素A对于线粒体未折叠蛋白质反应诱导的影响并不大；2）高渗环境并没有诱导线粒体未折叠蛋白质反应的发生；3）在线粒体未折叠蛋白质反应发生时，线虫并没有表现出躲避食物的行为。本文的结果为线粒体未折叠蛋白质反应消失的研究奠定了基础，对于线粒体未折叠蛋白质反应的研究具有重要意义。关键词：线粒体未折叠蛋白质反应，线虫，RNAi基因筛选 RNAi screen for genes responsible for the loss of mitochondrial unfolded protein response in adult C.elegans Author: GAO Kai-yu Mentors: LIU ying, ZHENG Li-sha AbstractMitochondrial unfolded protein response (UPRmt) is a novel and important program that allows mitochondrial chaperones to be induced in response to mitochondrial dysfunction. However, the detailed molecular mechanism of this response is poorly understood. C.elegans fail to induce UPRmt when they grow to the adulthood. Here we show that UPRmt cannot be induced by endoplasmic reticulum (ER) inihbitors and mitochondrial inhibition cannot induce ER unfolded protein response either. C.elegans lose their abilities to induce UPRmt at L4 stage and day 6 of adulthood respectively when they are exposed to mitochondrial RNAi (eg. atp-2, spg-7) or mitochondrial inhibitor antimycin A. We screened cherry picked RNAi libraries of transcription factors, kinases and neuropeptides, likely candidates in the signal transduction pathways for gene knock-downs capable to activate UPRmt in adult animals. A transcription factor zip-1 and a kinase mbk-2 were uncovered. In addition, we report here some unexpected findings: 1) UPRmt is activated at a stable level when C.elegans are treated with different concentrations of antimycin A exceeding 15ug/mL; 2) C.elegans cannot induce UPRmt when they are in a hypertonic environment; 3) when UPRmt is induced, C.elegans no longer avoid mitochondrial-toxic food. Our results provide additional information to understand the basis for the loss of mitochondrial unfolded protein response in adult C.elegans. The genes we identified in the RNAi screen will shed light on the molecular mechanism of UPRmt.Key Words: Mitochondria Unfolded Protein Response, C.elegans, RNAi Screen目 录1绪论11.1课题背景及目的11.2 国内外研究现状31.2.1 未折叠蛋白质反应31.2.2 线粒体未折叠蛋白质反应及其机理51.2.3 成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活71.2.4 线粒体未折叠蛋白质反应与线粒体自噬的关系81.3 课题研究方法91.4论文构成及研究内容102 研究方案112.1 研究目标112.2 仪器设备、材料、试剂药品的选择112.3 实验内容122.3.1 线虫化冻、培养及冻存122.3.2 线虫周期同步化132.3.3 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失的时期确定132.3.4 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失的基因筛选142.3.5 atfs-1点突变质粒的构建152.3.6 其他实验方法153 实验结果173.1 RNAi活性检测173.2 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失时期测定183.3 线粒体未折叠蛋白质反应消失的基因筛选253.4 线粒体未折叠蛋白质反应的特性273.4.1 不同浓度抗霉素A对线粒体未折叠蛋白质反应的影响273.4.2 线粒体未折叠蛋白质反应的特异性检测283.4.3 目前已知线粒体未折叠蛋白质反应有关的基因抑制303.4.4 发生线粒体未折叠蛋白质反应时线虫的避食行为313.5 atfs-1点突变质粒构建及检测324 讨论与展望354.1 成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失效354.2 线虫线粒体未折叠蛋白质反应的基因筛选364.3线虫线粒体未折叠蛋白质反应的特性384.4 atfs-1点突变质粒及应用394.4 展望40结论42致谢43参考文献44附录A 49附录B 51附录C 53附录D 55附录E 56附录F57附录G58附录H591绪论1.1课题背景及目的 从十八世纪四十年代线粒体被发现以来1，有数不清的科学家对线粒体进行着各方面的研究。在这个过程中，随着线粒体中三羧酸循环，脂代谢途径，电子传递链和氧化磷酸化等重要能量代谢途径的发现，线粒体正式成为了细胞的“能量室”。而且，这样一个概念维持了一个世纪左右2。直到上世纪九十年代末，线粒体在细胞凋亡中的作用才被人们知晓3。在近几年来，科学家发现线粒体功能及作用远比几十年前想象的复杂。也有越来越多的证据表明了线粒体对于细胞及生物个体的重要性。 其中，比较有意思的是对线粒体中活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）功能的了解。细胞在产生能量的过程中电子会不断地在电子传递链中传递，这个过程中电子会从电子传递链中泄漏，泄漏的电子极其活跃能够同氧气结合产生超氧阴离子，而超氧阴离子能够氧化其他物质，最后产生过氧化氢等活性氧物质4。也由此引出了著名的“线粒体自由基学说”，即在生物个体成长的过程中线粒体中积累的活性氧物质会不断地积累对线粒体、细胞和组织造成伤害，最终导致了生物个体衰老，这个学说在衰老领域统治了几十年5, 6。就这样，在很长一段时间内活性氧簇只是被当作伤害细胞的副产物，也确实有证据表明高剂量的活性氧簇能够导致细胞凋亡，坏死，诱发神经疾病，动脉粥样硬化和癌症等7。但是，有越来越多的证据表明，生理水平的活性氧簇对于调节细胞的正常生长是必不可少的，包括离子转运通道功能的维持，钙火花的产生8，蛋白质激酶的活性等7。不久前，还发现了线粒体超氧炫这样一种特殊的活性氧簇现象具有预测线虫衰老的功能9。除此之外，存在另外一种线粒体相关的衰老理论，这个理论认为线粒体内DNA的突变能够引起生物个体的衰老10。有一个非常有意思的实验是，在小鼠当中通过导入突变的RNA聚合酶可以让线粒体中表达错误的线粒体蛋白质11, 12，这足以使得小鼠早衰，但是用还原性物质维生素C处理后没有恢复蛋白质错误表达的现象也没有使得小鼠早衰的症状减轻，说明活性氧簇同衰老之间的关系并不是那么直接11, 13。 现在对线粒体已经有了更进一步的认识。线粒体中存在一些DNA，但是这些DNA的数量很少，大多数线粒体中的蛋白质需要细胞核编码，转录并且翻译之后才能转运进入线粒体中14。在转运的过程中，这些蛋白质是没有折叠的，所以需要在线粒体中进行折叠，这样才能发挥蛋白质的功能15，这个过程对于线粒体来说是一个非常繁琐的任务。除此之外，线粒体中的DNA不受组蛋白的保护易发生突变，活性氧簇的产生会引起蛋白质和DNA的损伤，由此使得线粒体折叠蛋白质的任务加重16, 17。不仅如此，在这个过程中还会受到很多其他因素的干扰。就线虫而言，这原本是一种生长在土壤中的生物，由于土壤中可能存在各种对线虫不利的化学毒素和生物，会对线虫线粒体造成进一步的伤害18。正是这些压力的存在，线粒体中没有折叠和错误折叠的蛋白质会不断堆积。这些没有折叠或者错误折叠的蛋白质的堆积对于线粒体来说是沉重的负担。 在这些负担的压力下，线粒体可能会表现出两种行为，一种是发生线粒体分裂，被分裂出来的损伤线粒体会同溶酶体融合、降解来减少对线粒体和细胞有害的蛋白质，这个过程称为线粒体自噬16。如果线粒体自噬仍然无法缓解蛋白质堆积压力，就会发生细胞凋亡19。另一种行为是，线粒体发出信号给细胞核，细胞核转录一些热休克蛋白帮助没有折叠或者错误折叠的蛋白质进行折叠或者清除，这样就能够使得线粒体的压力减轻，功能恢复正常，这样一个过程就被称为线粒体未折叠蛋白质反应20（图1.1）。线粒体未折叠蛋白质反应，线粒体产生错误折叠及没有折叠蛋白质主要有四个方面，包括来自细胞核编码的蛋白进入线粒体后需要折叠，线粒体中DNA突变转录出突变的蛋白质，活性氧物质的产生而伤害蛋白质及线虫摄入对线粒体有害的物质等。这种情况下，线粒体可以发出信号给细胞核，细胞核转录hsp-6等基因帮助线粒体内蛋白质折叠。这个过程被称为线粒体未折叠蛋白质反应。如果这个过程仍然无法维持线粒体内的蛋白质稳态，细胞会启动线粒体自噬及细胞凋亡等途径。图1. 1 线粒体未折叠蛋白质反应 有意思的是线粒体未折叠蛋白质反应同衰老21及寿命延长有密切的联系。在线虫中，利用RNAi（RNA interfere）的方法降低电子传递链的活性能够延长线虫寿命22，但是这种行为依赖于线粒体未折叠蛋白质反应23。也就是说，在抑制电子传递链活性的同时抑制线粒体未折叠蛋白质反应的组分线虫的寿命并不会得以延长。这就说明未折叠蛋白质反应对于衰老理论来说是一个新的补充。 对于人类来说，线粒体损伤和衰老同神经疾病（阿尔兹海默病，帕金森病等）有非常紧密的关系24。有很多证据显示，神经疾病患者缺少或者突变的蛋白大部分都是作用在线粒体的蛋白25。而对于我国这样一个进入人口老龄化的人口大国来说神经疾病多国家和社会造成的负担尤其沉重。根据国家统计局2014年1月发布的数据来看，在2013年底我国60周岁及以上的人口已经超过2亿。而有报道称60周岁以上老人患帕金森病的概率约为1%26，按照这个数据估算，我国帕金森疾病患者已经超过200万。另一种神经疾病，阿尔兹海默病，2010年是在全球的患病者大约为3300万人。对于痴呆病症上的花费达到了全球GDP总额的1%27。所以说，神经疾病对于家庭，社会和国家来说都是非常沉重的负担。 与此相关，在线虫中的研究发现利用RNAi的方法能够激活生长时期L3之前线虫的线粒体未折叠蛋白质反应。却不能够激活生长时期在L4之后的线虫的线粒体未折叠蛋白质反应23。这就让我们想到，线粒体未折叠蛋白质反应可能同神经疾病有重要的联系。神经疾病可能是由于线粒体未折叠蛋白质反应的缺失而引起的。我们实验室提出了这样的疑问，既然线粒体未折叠蛋白质反应在线虫中有如此重要的作用，为什么会在生长时期在L4之后的线虫中消失呢？于是我打算在这方面开始做一些基因筛选的工作，在线虫的转录因子，激酶，神经肽这三个线虫基因子文库中进行。了解成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应缺失与这些基因的关系。1.2 国内外研究现状1.2.1 未折叠蛋白质反应 未折叠蛋白质反应是一种处理错误折叠以及没有折叠的蛋白质的反应，存在于多种细胞器中，包括内质网，细胞质和线粒体等28。目前，对内质网和细胞质的未折叠蛋白质反应较为了解。因为内质网的重要作用是进行蛋白质加工折叠及运输。内质网中的未折叠蛋白质反应机制可以确保正确折叠的蛋白质被分泌到细胞外，错误的蛋白质在内质网中降解29。如果内质网中没有折叠及错误折叠的蛋白质过多，使得内质网没有能力去处理这些蛋白质那么内质网就会发出细胞凋亡的信号，确保生物个体的健康29。在内质网中，有三条较为了解的通路同内质网未折叠蛋白质反应有关。分别由PERK（protein kinase RNA-like ER kinase），ATF6（activating transcription factor-6）和IRE1（inositol-requiring protein-1）介导（图1.2）30。在细胞层面来说，这些通路的作用是减少转运到内质网中的蛋白并降低与内质网未折叠蛋白质反应无关蛋白的翻译，提高内质网未折叠蛋白质反应相关的蛋白帮助蛋白质进行折叠，降解错误折叠蛋白质从而降低线粒体的未折叠蛋白质压力29。内质网未折叠蛋白质反应的示意图。内质网中的蛋白质压力能够引起PERK（protein kinase RNA-like ER kinase），ATF6（activating transcription factor-6）和IRE1（inositol-requiring protein-1）等蛋白的表达，这些蛋白质代表了内质网未折叠蛋白质反应的三个分支。这三个分支均可以激活内质网中帮助蛋白质折叠的通路，而ERE1及PERK还可以通过elF2的磷酸化使得蛋白质翻译降低，这两个过程可以明显降低内质网压力。但是，如果内质网未折叠蛋白质反应依然不能维持蛋白质稳态，那么细胞就会启动细胞凋亡途径。图1. 2 内质网未折叠蛋白质反应的示意图30 与内质网未折叠蛋白质反应非常相似，线粒体未折叠蛋白质反应的作用也是帮助没有折叠的蛋白质进行折叠，降解错误折叠的蛋白质以减轻线粒体的负担。除此之外，在发生线粒体未折叠蛋白质反应的同时也会降低蛋白质向线粒体的运输31，与线粒体相关的蛋白质翻译的降低32等。，如果当线粒体无法处理这些错误折叠及没有折叠的蛋白质时，会发生线粒体自噬或者细胞凋亡，使得线粒体或细胞被降解。最近也有文章报道，抑制线粒体未折叠蛋白质反应相关的酶能够非常明显地增加线粒体自噬33。尽管我们已经了解了一些线粒体未折叠蛋白质反应的机制与现象，线粒体未折叠蛋白质反应的研究还远没有内质网未折叠蛋白质反应深入，还存在许多问题。目前，正在对线粒体未折叠蛋白质反应进行各方面的研究。就这个课题而言，我们希望用基因筛选的方法研究为什么线粒体未折叠蛋白质反应不能够在成年线虫中激活。该方面的基因筛选尚未被其他文献报道。1.2.2 线粒体未折叠蛋白质反应及其机理 就我们了解而言，线粒体中蛋白质的降解最早被发现于1996年，利用溴化乙锭的方法得到了线粒体DNA缺失的小鼠，在这些小鼠中的肝细胞中观察到了线粒体特异性分子伴侣蛋白cpn 60及分子伴侣蛋白cpn 10的上调及线粒体中蛋白质的降解34。而线粒体未折叠蛋白质反应机制的研究最近几年才被报道。在哺乳动物中，线粒体中错误折叠及没有折叠的蛋白质积累过多时，线粒体会通过JNK2（c-Jun N-terminal kinase 2）及PKR（dsRNA-activated protein kinase）途径使得转录因子c-Jun结合到AP-1作用元件激活CHOP及C/EBP的表达。之后CHOP及C/EBP结合到CHOP元件上使得线粒体未折叠蛋白质反应的相关蛋白得以表达19。另外一方面，线粒体能够通过PKR途径使得elF2（eukaryotic translation initiation factor 2-）磷酸化从而抑制mRNA的翻译（图1.3）35。对于线虫来说，目前发现参与线粒体未折叠蛋白质反应的组分有蛋白酶CLPP-136，线粒体内膜蛋白HAF-137，线粒体膜通道蛋白TIM31，转录因子ATFS-138，DVE-1及辅助转录因子UBL-536等。其中最为了解的是转录因子ATFS-1，在ATFS-1的两端分别具有线粒体定位序列和细胞核定位序列，在线粒体没有受到蛋白质压力的情况下，ATFS-1会进入线粒体中并且被降解，这样就不会诱发线粒体未折叠蛋白质反应。但是如果线粒体中存在蛋白质压力的话，ATFS-1的线粒体定位序列就会被降解，之后被运输到细胞核当中，启动线粒体未折叠蛋白质反应以帮助线粒体中蛋白质的折叠和清除38。相比较ATFS-1，参与线粒体未折叠蛋白质反应的其他蛋白的机制了解的相对要少一些。发现直接由相互作用的蛋白只有转录因子DVE-1及辅助转录因子UBL-5，DVE-1能够同UBL-5结合，然后共同结合到线粒体未折叠蛋白质反应相关基因的启动子上帮助相关基因的转录36。CLPP一种蛋白酶，在哺乳动物及细菌中具有清除错误折叠蛋白质的功能，也有报道称CLPP在线虫中同样有酶切错误折叠蛋白质的功能。之后这些蛋白质片段能够通过HAF-1这种转运蛋白运输到线粒体外激活线粒体未折叠蛋白质反应39。但是CLPP在线虫中的直接作用并不清楚，HAF-1的作用只在一篇文章中被报道，我们对它们的了解相对较少。哺乳动物细胞中的线粒体未折叠蛋白质反应，当存在线粒体压力时，JNK2（c-Jun N-terminal kinase）和PKR（dsRNA-activated protein kinase）会激活转录因子c-Jun，之后c-Jun能够同AP-1作用元件相结合，激活CHOP及C/EBP转录因子。CHOP和C/EBP在二聚后能够结合到CHOP作用元件上。之后可以诱导与线粒体未折叠蛋白质反应相关的蛋白质表达，包括HSP-60，CLPP等。目前MURE-1及MURE-2作用元件的调控还不清楚。而PKR还具有调节elF2从而降低蛋白质翻译的功能。图1. 3 哺乳动物细胞中线粒体未折叠蛋白质反应19除了以上直接清除错误折叠或没有折叠蛋白质的途径之外，还有两条旁路减轻线粒体蛋白质压力。其中之一是降低蛋白质翻译，通过GCN-2（general control nonderepressible-2）磷酸化elf-2降低mRNA的翻译32，这个过程同哺乳动物降低mRNA翻译相类似。另外一条旁路的作用是降低线粒体向内运输蛋白。通过转运蛋白TIM（translocase of the inner membrane）实现，有意思的是抑制TIM亚基TIM17A能够激活线粒体未折叠蛋白质反应，而线粒体未折叠蛋白质反应的过程中也会抑制TIM复合体的活性31。抑制线粒体蛋白质向内运输同线粒体未折叠蛋白质反应之间有密不可分的联系。另外，最近有报道发现甲羟戊酸前体物质-羟基-甲戊二酸单酰辅酶A的还原酶用斯他汀类物质抑制之后也会抑制线粒体未折叠蛋白质反应18。斯他汀是一类降低胆固醇的药物，在长期的使用过程中科学家发现这类药物会使得使用者产生肌肉疾病，有意思的是通过ATFS-1的线粒体线粒体定位序列删除诱导激活线粒体未折叠蛋白质反应之后可以减轻线虫中由于斯他汀引起的肌肉损伤40。说明甲羟戊酸途径也参与了线粒体未折叠蛋白质反应。除此之外神经酰胺合成途径也参与了这个反应18。但是，总体来说线粒体未折叠蛋白质反应的机制并不清楚。参与线粒体未折叠蛋白质反应的各种蛋白之间的关系还需要进一步研究。例如，参与ATFS-1转录因子线粒体定位序列剪切的酶是LON，而不是CLPP41，但LON这种蛋白酶在线虫中的作用被报道的却很少。CLPP在线虫的作用探究的文章也很少，有意思的是CLPP在真菌中被去除之后能够通过使得真菌的寿命延长。而这种寿命延长的作用可以通过导入人类CLPP基因去除42。说明CLPP是一个非常保守的基因在生物中发挥着重要作用。我们筛选成年线虫未折叠蛋白质反应缺失的基因对于线粒体未折叠蛋白质反应来说也是一种机制上的探索。1.2.3 成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应失活 cco-1是线粒体电子传递链复合体IV的亚基，用RNAi的方法抑制cco-1活性能够诱导线粒体未折叠蛋白质反应。有研究发现，在线虫生长的早期抑制cco-1的活性能够延长线虫的寿命，但是在成年后抑制cco-1的活性并不能延长线虫的寿命22。之后，进一步的研究发现这种线粒体电子传递链损伤导致的寿命延长是依赖于线粒体未折叠蛋白质反应的23。如果将线粒体未折叠蛋白质反应所需要的辅助转录因子UBL-5用RNAi的方法抑制之后线虫就不能够通过电子传递链的损伤而延长寿命23。另一方面，在同一篇文章中报道，线虫的线粒体未折叠蛋白质反应只有在L3时期之前能够被诱导，在L4时期之后不能够被诱导（图1.4）23。这个结果同幼年线虫线粒体组分被抑制后能够延长线虫寿命，而成年线虫抑制电子传递链的组分不能够延长线虫寿命相吻合。所以从两方面验证了线粒体未折叠蛋白质反应只能够在线虫幼年时期被激活23。 这是一个让人非常激动的现象，因为老龄及线粒体同神经疾病都有密切的关系。对于阿尔兹海默病来说，正常情况下A蛋白在合成之后会被运输到细胞外43，但是同阿尔兹海默病人一样，衰老的大脑中会有A蛋白的堆积，而A的堆积造成的结果是线粒体的损伤44。而帕金森疾病同线粒体也有非常明确的联系，线粒体电子传递链复合物I的抑制剂MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶），鱼藤酮等能够引起小鼠多巴胺能细胞破坏进而引起帕金森的症状45。与帕金森疾病有关的一系列基因都和线粒体有密切的关系，帕金森疾病患者的细胞内会有路易斯小体，而路易斯小体主要成分是与帕金森病相关蛋白PARK1及PARK4构成的突触核蛋白，在小鼠中增加突变后突触核蛋白会导致线粒体的损伤46。另外，还发现了帕金森疾病患者，阿尔兹海默病患者及年老动物中线粒体DNA突变、减少及线粒体减少的情况47。目前，已经找到了许许多多线粒体同神经疾病的关系，但是其确切的原因及特效的神经疾病的治疗方法都是目前未知的。有意思的是线粒体复合体I的抑制能够引起大量活性氧簇的产生，而活性氧簇的产生可以诱导线粒体未折叠蛋白质反应48，所以神经疾病同线粒体未折叠蛋白质的关系也是非常值得研究的。而对成年线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失进行基因筛选可以对该方面的联系进行了解。线虫在L4时期之后，线粒体未折叠蛋白质反应不能够用RNAi的方法的方法激活，但是可以在L3之前的时期激活。图中所用的线虫是hsp-6p:gfp线虫，绿色荧光的表达越亮表示线虫中线粒体未折叠蛋白质反应表达程度越高。Hatch是线虫刚孵化的时期，此时为L1时期。L2-L4是是线虫生长的时期。而YA指的是young adult时期，即线虫的青年期。图1. 4 成年线虫无法感知线粒体未折叠蛋白质反应231.2.4 线粒体未折叠蛋白质反应与线粒体自噬的关系 线粒体未折叠蛋白质反应同线粒体自噬有密不可分的关系。如前所述，由于种种原因线粒体中会堆积没有折叠以及错误折叠的蛋白质。这些蛋白质会损伤线粒体。这时候线粒体有两种反应，其中之一是启动线粒体未折叠蛋白质反应，对损伤的线粒体进行修复。而另外一个途径就是启动线粒体自噬甚至细胞自噬途径，消除受损伤的线粒体和细胞。从这种角度来讲，线粒体自噬是线粒体消除错误折叠或者没有折叠蛋白质的方法中比线粒体未折叠蛋白质反应更进一步的形式。 线粒体自噬的发生与线粒体未折叠蛋白质反应在形式上有一定类似。对于正常的线粒体来说，PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）会运输到线粒体中，然后被PARL复合体切除，最终被降解49。但是，当线粒体膜电位降低时，PINK1向线粒体内的运输会被阻断，并且积累到线粒体外膜上，募集与线粒体自噬相关的其他蛋白进行线粒体自噬的过程。有意思的是，在果蝇中PINK1突变后能够使得线粒体呼吸链突变所引起的线粒体未折叠蛋白质反应增强50。而在哺乳动物细胞中，抑制线虫LON酶同源基因LONP1能够诱导线粒体自噬33。这说明了线粒体自噬同线粒体未折叠蛋白质反应之间有非常紧密的联系。1.3 课题研究方法 本实验主要使用的研究方法是线虫RNAi的方法：对于线虫来说，RNAi是一种非常方便的抑制基因表达的手段。首先需要获得能够诱导与线虫中特定基因序列相同的双链RNA的细菌。当细菌中表达出双链RNA并被线虫进食后，双链RNA会在线虫中降解形成小片段，然后同线虫RNA互补。这时，线虫能够启动自身的RNA降解机制将RNA降解。通过这样的方法，就可以使得线虫中某个基因的表达失效。 在这个实验中，我们首先要对不同时期的线虫进行spg-7，atp-2基因的RNAi和药物抗霉素A的刺激，由于我们实验室已经有线粒体未折叠蛋白质反应启动子同绿色荧光蛋白相连的hsp-6:gfp转基因线虫，通过观察线虫是否在荧光显微镜下表达绿色荧光就可以判断线虫是否发生线粒体未折叠蛋白质反应。这样我们就可以知道线虫在哪个时期出现线粒体未折叠蛋白质反应无法感知的现象。在得到线粒体未折叠蛋白质反应无法感知的时期之后，我们将要利用双RNAi方法进行激酶、转录因子和神经肽等几个基因文库的大约1036个基因进行筛选。在这个过程中，首先让线虫在需要筛选的基因上生长到不能诱导线粒体未折叠蛋白质反应的时期，检查线虫的生长状态，观察线虫是否发生了线粒体未折叠蛋白质反应，然后再给予线虫spg-7 RNAi的刺激，观察线虫是否能够发生线粒体未折叠蛋白质反应。如果线虫在这个时候发生了线粒体未折叠蛋白质反应，那么我们认为筛选的基因与线虫线粒体未折叠蛋白质 反应的缺失有重要关系，否则关系较小。1.4论文构成及研究内容本文包括摘要、绪论、研究方案、实验结果和讨论五个部分。主要是研究方案的设计与开展，阐述相关实验的操作方法，实验结果的展示，得出结论并讨论。论文内容还包括结论，致谢，参考文献和附录部分。2 研究方案2.1 研究目标线粒体未折叠蛋白质反应是近年来发现的线粒体中没有折叠接及错误折叠蛋白质清除及重新折叠的反应。在线虫生长的幼年阶段可以使用RNAi的方法诱导线粒体未折叠蛋白质反应激活，但是在线虫成年阶段却不能用RNAi的方法将线粒体未折叠蛋白质反应激活。而线粒体未折叠蛋白质反应具有非常重要的作用，为什么会在成年时期消失呢？ 本实验计划探究线虫生长阶段中不能感知线粒体未折叠蛋白质反应的具体时间，并主要用高通量筛选技术去探索为何在成年时期的线虫中线粒体不能感知外界压力，激活未折叠蛋白质反应。得到成年线虫不能感知线粒体未折叠蛋白质反应的有关基因。简单地分析这些基因与线粒体未折叠蛋白质反应的关系。为该方向以后的研究奠定坚实的基础。2.2 仪器设备、材料、试剂药品的选择 仪器设备：荧光显微镜（Imager.M2，Carl Zeiss），荧光体视镜（szx7，Olympus），体视镜（smz-168，麦克奥迪），20培养箱（HP4000S，瑞华仪器），-4冰箱（海尔），-20冰箱（海尔），-80冰箱（Thermo），超纯水净化器（Pall），高压灭菌锅（Zealway），蠕动泵（LongerPump），移液器（Drummond），移液枪（Eppendorf），超净工作台（东联哈尔），超净工作台（Airtech），PCR仪（ETC811，东胜），金属浴（Eppendorf），微波炉（美的），跑胶仪（Tanon），低速离心机（SC-3610），离心机（Eppendorf），多道移液器（100L，300L，Eppendorf），微电机拉制仪（Sutter），电子天平（Jinghai），电子天平（Sartorius），显微注射显微镜及配套设备（Zeiss）及胶成像仪（Tanon）等 实验材料：小提试剂盒（康为），胶回收试剂盒（康为），60mm培养皿（海门金虹），90mm培养皿（海门金虹），81格纸盒（海门金虹），14mL圆底试管（BD Falcon），不锈钢药匙，一次性手套（AMMEX），枪头（Axygen），15mL离心管（NEST），不同规格蓝盖瓶，不同规格锥形瓶，灭菌指示带（3M），锡箔纸，封口膜（BEMIS），24孔板（康宁），96孔板（康宁），盖玻片，载玻片，96孔摇菌板（康宁），无孔平板（海门），冻存管（Thermo）等。 试剂药品：抗霉素A（Sigma），2X Taq 酶混合液（康为），1kb DNA 标记（Tiangen），磷酸氢二钾（西陇化工股份有限公司），无水乙醇（北京化工厂），磷酸二氢钾（西陇化工股份有限公司），硫酸镁（西陇化工股份有限公司），氯化钠（国药集团），次氯酸钠（西陇化工股份有限公司），甘油（国药集团），氢氧化钠（北京化工厂），Gold View染料（AOVE），琼脂糖（Biowest），酵母提取物（OXOID），IPTG（MERCK），蛋白胨（BD），琼脂（Japan），氯化钙（国药集团），四环素（Amresco），NheI内切酶（NEB），KpnI（NEB），硫酸链霉素（Amresco），叠氮化钠（Amresco）等。2.3 实验内容2.3.1 线虫化冻、培养及冻存 实验材料：hsp-4p:gfp线虫，hsp-6p:gfp线虫，冻存缓冲液，M9缓冲液，线虫生长培养基，LB固体及液体培养基等 线虫化冻：取出冻存在-80的线虫冻存管，放置在室温条件下约半小时使得冻存管中的固体完全溶化后。用移液枪吸取冻存管底部的沉淀50L，滴到铺有OP50细菌的线虫生长培养基上。室温放置2小时左右可以观察到线虫开始苏醒，如果没有观察到线虫苏醒，可以再等待几小时。若超过2天仍未观察到线虫苏醒，仍为冻存管中没有活的线虫。 线虫冻存：预先配置含有30%甘油的冻存缓冲液。等待线虫生长到L1及L2时期，并饥饿2天以上后可以开始冻存线虫。首先，用M9缓冲液将线虫从培养皿下来并分装到冻存管中，每个冻存管中放入400L含有线虫的M9缓冲液，然后再加入400L冻存缓冲液，标注线虫种类后就可以直接放入-80冰箱中进行保存。（详细步骤参见附录A） 线虫培养：线虫培养过程中需要配制线虫生长培养基，LB液体培养基及LB固体培养基。其中LB固体培养基用于OP50细菌的划线生长，在LB固体培养基上的OP50细菌可以在4条件下保存一个月，超过一个月需要重新化冻并划线。LB液体培养基用于OP50细菌的繁殖生长以获取足量OP50细菌供线虫食用。首先需要在LB固体培养基上挑取OP50细菌的单菌落放入液体LB培养基中，在37摇菌14-16小时后可以将OP50细菌放到线虫生长培养基上，摇匀，室温晾干后即可用于线虫的培养。向线虫生长培养基加入OP50细菌时，每个6cm培养皿加入0.5mL菌液，每个10cm培养皿加入2mL浓缩20倍的菌液。（详细步骤参见附录B）2.3.2 线虫周期同步化 实验材料：怀孕线虫，线虫裂解缓冲液，M9缓冲液等。 实验步骤：进行线虫周期同步化的线虫来自10cm平板的线虫生长培养基，每次裂解线虫的数量约为2000条。首先，让线虫生长到怀孕第一天或第二天。这时用大约8mL的M9缓冲液将线虫从培养皿上洗脱，放入15mL的离心管中3500转/分钟离心1分钟。再将多余的上清丢弃至3mL，加入3mL裂解缓冲液。剧烈上下摇晃1分钟后，迅速加入12mL的M9缓冲液。再次3500转/分钟离心1分钟，丢弃上清至3mL。然后，再加入3mL裂解缓冲液剧烈上下摇晃至成年线虫裂解为线虫片段后，加入12mL的M9缓冲液。然后按照以下步骤重复3次：3500转/分钟离心1分钟，丢弃上清，加入15mL的M9缓冲液。最后，再以3500转/分钟离心1分钟，弃去上清后加入8mL左右的M9溶液。离心管放到小型摇床上，20环境下放置12小时后可以得到孵化的线虫。（详细步骤参见附录C）2.3.3 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失的时期确定2.3.3.1 RNAi培养板的制作 实验步骤：首先称量RNAi培养基所需的各种成分，120灭菌20分钟。之后加入硫酸镁，胆固醇等试剂。等到培养基冷却到60时，加入硫酸镁，链霉素，羧苄青霉素等物质。其中羧苄青霉素的作用是抑制培养基中霉菌的生长，IPTG的作用是诱导RNAi细菌质粒的表达。之后，利用蠕动泵将培养基分装到24孔板中，每个孔中加入1.5mL培养基。在室温中放置2小时以上就可以使得培养基凝固。由于培养基中含有IPTG，容易分解，需要放置于-4冰箱中，放置时间不超过一个月。（详细步骤参见附录D）2.3.3.2 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失的时期确定 实验步骤：首先摇菌获得大量的L4440细菌，然后在24孔板的每个孔中加入100L的L4440菌液。室温晾干后就可以放入刚孵化的线虫，每个孔放入大约20只hsp-6p:gfp线虫。等到线虫生长到不同的时期后在孔中放入20倍浓缩后的 RNAi细菌（spg-7或者atp-2）20L或者0.5g 抗霉素A（溶于20L的M9缓冲液中）。对于RNAi处理的线虫来说，48小时后利用荧光体视镜观察线虫荧光。对于抗霉素A处理的线虫来说，24小时后利用荧光体视镜观察线虫荧光。2.3.4 线虫线粒体未折叠蛋白质反应消失的基因筛选2.3.4.1 96孔培养板复制器的清洁 复制器是带有与96孔板吻合的96针的金属器件。非常方便与96孔板间细菌的转移。但是复制器在使用的过程中需要转不同的细菌，所以每次使用之后需要对复制器上的针进行清洁。首先准备尺寸与复制器吻合的三个小方盒，依次分别放入10%次氯酸钠溶液，超纯水，乙醇。在清洁过程中需要重复以下步骤两次：1）将复制器的针浸入到10%次氯酸钠溶液中。2）取出复制器并放入超纯水中，将针上的次氯酸钠溶液洗净。3）将复制器的针放入乙醇溶液中，取出后将针上的乙醇燃尽，这个过程需要重复两次。2.3.4.2 RNAi细菌的复苏及生长 首先需要制作AT板（氨苄青霉素-四环素），然后用复制器把12个96孔板中冻存的RNAi细菌，转录因子，神经肽及激酶三个线虫基因子文库中的基因转移到AT板上。37放置14小时后，可以观察到AT板上长出了细菌，这个过程就是细菌的复苏。（详细步骤参见附录E） 在细胞复苏之后需要让细胞生长，这样线虫才有足够的食物。当线虫进食RNAi细菌之后RNAi细菌中表达的双链RNA会被降解成小的片段并特异性的同线虫mRNA结合，之后结合的片段就会被线虫中的酶降解。总的来说，这个过程就可以使得线虫中的某个基因的表达失效。为了获得足量的RNAi细菌，需要在可以摇菌的96孔板的每