白藜芦醇对小鼠肾脏衰老的影响

北京航空航天大学毕业设计（论文） 第 43 页 白藜芦醇对小鼠肾脏衰老的影响 学 生：李忠持指导老师：王 钊 易宗春摘 要衰老是人类不可避免的复杂生理现象，而肾脏是伴随着衰老而出现明显形态和功能改变的重要器官之一。有研究发现，长期高脂饮食习惯会严重影响大鼠的认知能力，使机体出现提前衰老的症状1。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌2、抗氧化3、调节血脂4、影响寿命5等多方面有益于人类健康的重要功能。沉默信息调节因子-2家族在很多种模式生物中已经成为一类对于衰老起着关键作用的调控因子，它们具有高度保守的酶催化核心结构区域。哺乳动物Sirtuins家族由7个成员组成， 其中SIRT1被多次认定为长寿基因6。近年来，越来越多的研究发现SIRT6作为哺乳动物中NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，对机体寿命调控有重要作用7。研究发现：白藜芦醇等植物中多酚类小分子主要是通过激活组蛋白去乙酰化酶的活性，进而调控下游基因转录及活性来实现的8。本试验中使用的实验动物是经过高脂饮食、高脂饮食加白藜芦醇、正常饮食、正常饮食加白藜芦醇四种培养方式培养三个月后获得的，提取肾脏组织后分别进行PAS、HE、Masson、-gal染色。提取组织蛋白和RNA，通过western blot来检测SIRT6的表达量以及NF-B的乙酰化水平，通过Real-time PCR技术检测SIRT6的RNA表达水平。研究结果：从四种染色结果分析发现白藜芦醇对高脂饮食引起的肾脏早老具有改善作用，但对于正常饮食的小鼠肾脏无明显作用；进行高脂饮食处理的小鼠肾脏SIRT6表达量最低，乙酰化的NF-B表达量最高，经过白藜芦醇作用后，SIRT6表达量升高，乙酰化的NF-B表达量下降；对于正常饮食的小鼠是否加入白藜芦醇对SIRT6和乙酰化的NF-B表达量的影响不大。从而得出，白藜芦醇确实可以改善由高脂饮食引起的肾脏衰老，而且可能是通过调节NF-B的乙酰化水平来实现的，但对于正常饮食的小鼠，白藜芦醇没有明显的改善作用。关键词：肾脏衰老，白藜芦醇，高脂饮食，SIRT6，NF-BEffects of resveratrol on aging kidney of mice induced by high-fat diet Author: LI Zhong-chi Tutor: WANG Zhao YI Zong-chunAbstract Aging is an inevitable physiological phenomenon full of complexity, and the kidney is one of the most vital organs accompanied by significant morphological and functional changes. From the study of model animals, we have confirmed that high-fat diet is the key cause of cardiovascular disease. Long-term high-fat diet would adversely affect cognitive abilities in rats, so that the body appears premature aging symptoms 1. Resveratrol is a natural polyphenol with strong Biological activity. It is not only generated when the plant suffered a stress, so that it can increase plants resistance to pathogenic attack and worsening environmental, also has many important functions of anti-cancer 2, antioxidant 3, regulating blood lipids 4, infecting life 5 and so on, which are beneficial to human health. Sirtuin-2 family plays a key role in the regulation of the aging factor in a variety of model organisms, which have a highly conserved core structure of a class of enzymes catalyzing regions. Sirtuins family in Mammalian consist of seven members, and SIRT1 has been repeatedly identified as longevity gene 6. In recent years, a growing number of studies have found SIRT6 plays an important role in regulating life as mammalian NAD +-dependent histone deacetylase 7. The resveratrol and other polyphenols in plants can activate small molecules histone deacetylase, thereby downstream gene transcription and activity 8.The experimental animals used in this experiment is fed through high-fat diet, high-fat diet plus resveratrol, a normal diet and normal diet plus resveratrol four means, and we get their kidneys after three months. After that we test the kidney tissues though PAS, HE, Masson, -gal staining. We extract the tissue total proteins and total RNA, detecting the expression levels of SIRT6 and acetylation of NF-B by western blot and Real-time PCR. Results: from the four ways of staining, we find that resveratrol could improve premature aging kidney induced by fat diet, but not for normal kidney. For the kidneys conducted with high-fat diet, they express the lowest SIRT6 proteins, but acetylation of NF-B expression was highest. After treated with resveratrol, the expression level of SIRT6 has increased, and the acetylation of NF-B has decreased. For mice on a normal diet, the resveratrol has little impact on the expression of SIRT6 and acetylation of NF-B. In conclusion, we find that resveratrol can indeed improve the high-fat diet-induced kidney aging, which may be resulted by the regulation of acetylation of NF-B, but not for the mice with normal diet.Key Words: aging kidney, resveratrol, high-fat diet, SIRT6, NF-B目 录1 绪论11.1课题背景及目的11.2国内外研究状况31.3论文构成及研究内容102 研究方案122.1研究目标122.2仪器设备、材料、试剂药品的选择122.3实验内容133 实验结果183.1PAS染色结果183.2HE染色结果193.3Masson染色结果213.4SA-gal 染色结果223.5Western-blot 结果243.6Real-time PCR 结果254 讨论与展望264.1高脂饮食诱导肾脏衰老264.2白藜芦醇对高脂饮食引起的肾脏衰老有缓解作用274.3SITR6在白藜芦醇缓解衰老过程中发挥作用284.4展望28结论31致谢32参考文献33附录A BCA 法测蛋白质浓度35附录B western blot 操作方法36附录C Real-time PCR 操作流程39 1 绪论1.1 课题背景及目的2011年进行了我国第六次人口普查，结果显示，中国人口的老龄化加速，65岁及以上人口的比例上升了1.91个百分点，国家即将面临非常严重的老龄化问题。因此，有关老龄化和衰老的研究已经是刻不容缓。随着社会的不断进步，人民的生活水平不断提高，人们对于健康的要求也越累越高，于是在世界范围内的衰老研究，正在火热进行中。对于衰老的定义，多年来众说纷纭，基本上可以总结为人体各个组织和器官在各种内、外环境的长期作用下，各器官功能逐渐减退的过程。其中，肾脏的衰老对机体的影响尤其重要。在肾脏的衰老过程中，一般都会出现形态、结构以及功能上的变化，这在临床上的表现可能为肾功能的减退，肾储备能力的下降以及对应激耐受的能力降低等。人们的两个肾在40岁左右便开始出现体积的缩小和重量的减轻，在75岁左右时，肾脏的重量下降约30%，体积也会下降20，造成这个结果的原因是随着年龄的增加，结构正常的肾小管和肾小球的数量会发生进行性的减少，他们的功能也会发生进行性的减退9。肾小管萎缩，肾小球硬化及肾间质的纤维化通常是老年人肾脏的主要病理改变。有研究显示：健康的成年人在30岁后就可能出现肾小球硬化，但比例一般不超过3，60岁69岁可增高到l0，70岁79岁时甚至高达l9，高于80岁的老年人约25的肾小球完全硬化。由于硬化的肾小球逐渐增多，这会直接影响肾小球滤过率(GFR)，有研究证实，40岁以后，肾小球的滤过率在每l0年可减少810 mlmin10。随着年龄增长，硬化肾小球数目增多的机制还不明确，但血管的病变和肾小球内血流动力学的改变可能是至关重要的因素。血流动力学的改变不但可以使肾小球发生病变，促使其硬化，而且对肾小管和肾间质的病变有一定的促进作用。供血不足在根本上推进了肾小管和间质的衰老。有研究表明，肾脏的70-80的血供是来源于出球小动脉的分支，因此，肾小球的病变(如硬化、炎症等)会严重减少出球小动脉的血流量，从而导致肾小管上皮细胞出现空泡样变性，甚至凋亡，肾小管会出现萎缩和纤维化，这也使间质的体积明显增大。老年人的肾脏对各种损害威胁的承受能力因此而降低，发生肾衰竭的可能性也在很大程度上提高。第一次把生物寿命和能量代谢联系在一起的是近100年前的德国生理学家Rubner9。他检测了5 种哺乳动物的能量代谢输出，发现不同物种的寿命限制存在显著差异，但不同物种代谢率（即单位体质能量代谢）以及生命过程中的能量输出差别不大。1928 年这个观点被提出，在整个生命过程中，物种的代谢率和它的寿命是呈负相关的，生命能够持续下去是与能量消耗密切相关的，如果代谢率越高，能量消耗越高，那么衰老的速度就越快，寿命就会越短。在模式生物以及动物实验的研究中证实，高脂饮食是引起心脑血管疾病的关键原因，长期高脂饮食患有过度肥胖甚至二型糖尿病的概率也有相当程度的提高。有研究发现，长期高脂饮食习惯会严重影响大鼠的认知能力，进而使机体出现提前衰老的症状1。这个现象也会出现在人类的身上，对于这个问题，除了控制饮食能有效避免提前衰老之外，找到有效的药物来缓解高脂饮食带来的危害也成为了另外一条途径。白藜芦醇(Resveratrol)是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它广泛的存在于葡萄、虎杖、松树、决明子和花生等天然植物中，到目前为止，至少已经在21科、31属的72 种植物中发现有白藜芦醇。它是许多植物受到各种胁迫(如真菌感染、紫外照射等)时产生的一种植物抗毒素。白藜芦醇不仅能使植物的生存能力提高，研究发现它还具有许多对人类健康有益的生物学活性以及药理作用，这也使它多年来被广泛重视，对于白藜芦醇的研究也日益增多。白藜芦醇的化学名称为3, 5, 4-三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3，分子量为228.25 kd,是无色针状晶体，难溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等极性溶剂2。目前能够在市场上买到的白藜芦醇大部分还是通过植物提取技术获得的，但是这种方法的成本非常高，最后的产率也不高，关键是植物资源也是有限的。近年来，白藜芦醇在心血管和肿瘤等疾病中的作用越来越受到人们的重视，国内外对白藜芦醇的合成研究有了很大进展。目前已经可以成熟应用五种化学合成的方法来合成白藜芦醇。随着人们生活水平的提高，人们对食品营养及医疗保健需要也有了提升，通过基因工程的手段来提高植物中白藜芦醇含量的研究已经成为白藜芦醇分子生物学研究的另一个热点。沉默信息调节因子2（Silent mating type information regulation 2, Sir2）家族作为一类对衰老起着至关重要的调控因子在许多生物中发挥着巨大的作用，从噬菌体到人类以及各种生物体中，Sir2蛋白都是非常保守。这些不同生物体中的Sir2蛋白极其同源类似物被称作“Sirtuins”，它们的酶催化核心结构区域高度保守6。哺乳动物的Sirtuins家族由7个成员组成，即SIRTt1SIRT7。其中，SIRT1被多次认定为长寿基因。经研究发现，SIRT1可以通过一个潜在的机制增加寿命，延缓衰老，而且这个过程是与热量限制密切相关的。哺乳动物中SIRT6作为NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，在机体寿命的调控过程中发挥了重要作用，它们主要表现在：(1) 调控炎症反应；(2) 维持基因组和端粒稳定；(3) 调节糖和脂肪的能量代谢 7。对于SIRT1在衰老过程中的作用的相关研究已经持续了很长时间，一直是科学界关注的热点，但几年前新研究发现SIRT6在衰老过程中也发挥着关键的作用，在动物实验中，也多次被证明能够调控衰老，但在器官层面的研究并不多。核转录因子NF-B是在炎症，衰老和凋亡中发挥重要功能的转录因子，而且在衰老的组织器官中，NF-B被激活的强度增高。在某些应激条件下，与NF-B结合的抑制子IKK(inhibitor of nuclear factor B kinase)会发生解离，IKK经泛素化降解, NF-B进入细胞核，诱导下游靶基因的表达。已有研究证明SIRT6与NF-B有相互作用11。本实验将三月龄的小鼠采用四种不同培养方式来饲养，分别为高脂饮食、高脂饮食加白藜芦醇、正常饮食、正常饮食加白藜芦醇，培养三个月后，取出各个小鼠的肾脏组织，一部分用于切片包埋，分别进行HE、Masson、PAS、-gal染色，来判断不同肾脏组织的衰老情况，此外提取肾脏组织的总蛋白和RNA，检测SIRT6和乙酰化NF-B蛋白的表达量，以及SIRT6的RNA水平，从分子角度检测肾脏衰老情况，并尝试对结果做出解释。最后综合实验结果，判断白藜芦醇对于高脂饮食带来的后果是否有改善作用，而对于正常饮食的小鼠，白藜芦醇能否会进一步提高健康程度，进而为肾脏衰老研究奠定基础。1.2 国内外研究状况1.2.1肾脏衰老的表现、机制以及对机体产生的影响研究发现，肾脏体积在人40岁左右时达到最大，质量约为400g，长度约为12cm，40岁以后，肾脏的体积会每10年以大约10%的速度递减，男性与女性相比更加明显10。在功能上主要表现为肾小球的滤过滤和肾血流量的下降。有研究发现，与青年组相比，老年组患者滤过膜面积、单个肾小球超滤系数、以及肾小球的体积都明显增大，而滤过膜的有效通透系数没有发生明显改变，这个现象提示老年人的肾脏存在肾小球代偿性肥大。因此，作者推测可能是因为在衰老过程中，肾单位出现了功能受损和数量减少，为了维持正常的肾功能，残余肾单位才会出现代偿性肥大，但是经过长期高灌注、高滤过等类似因素的作用下，原本肥大的肾小球发生了萎缩硬化。在不可逆的肾损伤中，肾小球硬化是发生率极高的一种，随着年龄的增加，其硬化率在成年以后逐渐增高，并与高血压等因素的影响无关12。肾小球功能的下降主要明显体现在肾血流量的下降和肾小球滤过率的下降。然而，尽管对于同一个肾脏，肾血流量在不同部位的下降速度也是不同的，这个现象是与皮质肾单位的丢失和肾皮质血液异常分流至肾髓质有很大的关系。目前研究已经明确，在不同性别个体中肾血流量的变化也会有区别，而且这个变化还会受到疾病和高血压的影响，相比之下，男性比女性的肾血流量下降幅度更明显，高血压患者比血压正常的个体肾血流量下降幅度更大9。在衰老过程中，与肾脏有关的内分泌系统功能的改变和肾脏自身调节能力的改变也是导致慢性肾损伤的因素，当肾素血管紧张素系统及一氧化氮系统的功能出现异常，或肾血管对舒血管物质的反应性减弱，或对促进血管收缩的物质反应性增强时，肾血流量将会明显下降，并导致诸如血压正常缺血性肾病患者肾组织病理性变化13。研究发现在肾脏衰老过程中，线粒体等亚细胞结构也会出现衰老的改变，而且这个过程还常伴有脂褐素的沉积。脂褐素，也叫做老年素，是黄褐色的不规则小体，在衰老过程中可以在神经细胞、心肌细胞、肝脏细胞等组织细胞中发生沉积。这里提到的脂褐素与普通的脂褐素不同，溶酶体也无法降解，这些脂褐素大量蓄积后会导致溶酶体崩解破裂，进而释放出各种酶，这就会导致细胞结构和功能发生损伤。众所周知，肾小球的足细胞的靶点可以是身体中的代谢产物、免疫及氧化应激等等因素，然而足细胞自身修复能力有限。最近的研究发现，自体吞噬作用是细胞提高对损伤的应激能力和自身修复能力的有效方式。在最初的时候，人们认为自体吞噬作用只是细胞对半衰期比较长的细胞质蛋白质以及功能受损的细胞器的非选择性降解作用，是细胞的天然防御方式。如今我们已经明确，自体吞噬作用主要是通过将细胞内受损的细胞器及蛋白质降解，从而能够平衡细胞稳态和疾病的发生。将与自体吞噬有关的基因特异性敲除后，肾小球的足细胞会出现蛋白质和线粒体的蓄积以及功能异常或缺失的现象，这就大大影响了足细胞正常功能。然而，这些在衰老细胞中也会发生类似的改变，从而说明了自体吞噬系统很可能参与细胞衰老的调控过程14。曾经有报道提出基因的异常表达可能是引起衰老原因。通过基因芯片技术，人们筛选出了肾脏衰老相关基因，发现、蛋白质合成相关基因、能量代谢相关基因细胞周期有丝分裂相关基因及DNA-RNA损伤修复相关基因等在衰老肾组织中的转录水平显著下降，而应激反应相关、肿瘤相关基因、炎性反应相关基因、细胞外基质代谢-细胞骨架相关基因的表达发生明显上调。此外，在衰老的肾组织中，尤其是富含线粒体的近曲小管中，可以发现DNA突变增多。Klotho基因是一种衰老抑制基因，当其在体内过度表达时，可延缓衰老过程，如果通过干扰大鼠这个基因表达缺陷，则可加速其器官衰老15。 在衰老个体中，肾脏细胞对有毒物质的处理能力以及体内外各种刺激的反应性明显下降，细胞更容易感受凋亡的刺激。自由基在细胞内大量蓄积，多是由于在有氧代谢、感染、损伤以及炎症反应过程中产生的自由基水平与机体自身产生的自由基清除剂（如超氧化物歧化酶、维生素C、E及硒等）清除氧自由基作用的失衡导致的，这就引起了细胞内蛋白质结构和功能的严重受损，进而发生细胞凋亡。当然，组织缺氧、组织纤维化及炎性反应相关分子的产生和衰老细胞分泌生长因子水平的变化，这几个因素也可能与肾脏的损伤及修复能力下降有关。目前的研究报道提及了许多关于衰老的机制，但是没有任何一个确定的机制，而且多数研究还只是集中于某一个机制上。随着衰老过程的延续，肾脏的细胞结构、肾小球形态及功能，以及肾小囊等结构都会发生明显的变化，尽管在衰老的个体中都会发生，但不同的饮食习惯，以及各种疾病如高血压、糖尿病等疾病，还有其他因素如吸烟、肥胖、药物滥用的影响，都会是使衰老在个体之间表现出差异性。1.2.2 白藜芦醇有效延缓机体衰老白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，它含有芪类结构。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗环境恶化和病原性攻击的植物抗毒素，还具有调节血脂、抗氧化、抗癌、影响寿命等多方面对人类健康有益的重要功能2。目前已经有多种化学和生物的方法来制备。作为植物的代谢产物，白藜芦醇的多种生物学功能都深深地吸引着人们，也被多次证明了具有明显的保健作用。随着对其越来越多的功能研究，人们对其发挥功能的分子机制也有了初步了解。有研究发现：不仅白藜芦醇有这样的保健效果，在植物中还存在着多种多酚类小分子物质，如漆树黄酮、紫铆因等都具有较强的抗氧化、抗自由基作用，它们发挥功能主要是通过激活组蛋白去乙酰化酶的活性，从而调控下游基因的转录及活性来实现的。SIRT1是Sirtuins 家族成员之一，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白去乙酰酶，可以调控许多转录因子，如抑癌基因(Tumour suppressor gene, p53)、叉头转录因子(Forkhead box class O, FOXO)等。作为底物，具有调控基因沉默、调节代谢过程、影响寿命长短等功能。哺乳动物中SIRT1 与酵母染色质沉默因子Sir2(Slient information regulator 2)同源，主要通过与一些相关的细胞因子相互作用来发挥其功能16。白藜芦醇可以激活SIRT1的活性，进而调控一系列反应。在白藜芦醇的多种药理作用中，抗癌、抗肿瘤的作用是最受人们关注的。癌症一般具有3个阶段（起始、增殖、发生），在进一步的研究中发现，白藜芦醇对这3 个阶段都有明显的抑制作用，甚至会发生逆转。近几年研究表明：白藜芦醇可以通过抑制由MAPK或NF-B途径调节的信号转导通路来促进癌细胞的自溶2。白藜芦醇可以通过减少舒张血管、心肌缺血、抗动脉粥样硬化、再灌注损伤等现象发挥保护心血管的作用。浓度为0.1mol/L的白藜芦醇可以使血管舒张，进而可以降低血压和降低患心血管疾病的风险。在中国的民间，早就有用富含白藜芦醇的中药来治疗和预防一些心血管疾病的记录。最近也有研究表明，白藜芦醇是一种有效的预防心脏功能紊乱的天然分子4。随着对白藜芦醇报道的增多，也逐渐引起了人们对其他多酚类物质的关注，近年来发现多酚类物质大多都含有显著的抗氧化、抗自由基的作用。有研究报道称，当将白藜芦醇的浓度控制在1.3 g/mL时，能明显抑制在大鼠红细胞中由过氧化氢引起的氧化溶血和自氧化溶血，并且对小鼠体内过个器官的过氧化脂质的产生有明显的抑制作用。 多酚类物质能够显著增加LDL(Low-density lipoproteins, LDL)的抗氧化活性，其中白藜芦醇的活性最强。研究表明，对于防治衰老相关的氧化胁迫，白藜芦醇具有良好的作用。由于白藜芦醇有抗氧化作用, 它可能通过调节乙酰胆碱酯酶来改善AD(Alzheimers disease)小鼠的认知能力3。以上的这些功能足以证明白藜芦醇的重要保健作用，后续的研究中还发现在变态反应、免疫调节、抗病毒等过程中，白藜芦醇也会产生一定的影响。相比与其它保健分子，白藜芦醇的典型优势是能够直接食用和吸收，因此，人们尝试将白藜芦醇作为食品添加剂，添加到药品、食物、饮料甚至化妆品中，作为一种新型的美容保健品，进而达到美容养颜，抗衰老的目的。这无疑对于保健品市场来讲，白藜芦醇会发挥重要作用。1.2.3 Sir2家族在机体衰老过程中发挥重要作用沉默配型信息调节蛋白是一类广泛存在于生物体，与寿命调控相关的蛋白质，在酵母体内发现了其家族的首个成员SIR2，过表达SIR2能够有效抑制rDNA(ribosomal DNA)重复序列的重组，从而延长酵母寿命6。这个家族族中共有七位成员，其中被研究最广泛的，也被发现功能最重要的是SIRT1蛋白。SIRT1 能够将抑癌基因p53 特异位点的赖氨酸残基去乙酰化，从而抑制了p53 介导的细胞凋亡，这就使细胞能够继续分裂生长。而肿瘤抑制因子DBC1 是SIRT1 的一个负调控因子，由于抑制了SIRT1的表达，DBC1 促进肿瘤抑制因子p53 发生更多乙酰化反应，从而促使人类细胞发生由p53 诱导的凋亡。此外，SIRT1 还能够通过抑制DNA 修复因子的乙酰化，阻止Bax 转位到线粒体，从而抑制细胞凋亡。但也有研究认为SIRT1 可增强p19ARF /p53 信号通路的活性，诱导体内细胞进入复制性凋亡17。坚持减少饮食中热量的摄入，从而延长寿命的方法，被称为限制热量摄取，即热量限制。 有研究认为热量限制之所以能够延长寿命是与SIRT1 的活性有关。摄取较少热量会延长生命周期，但却容易引起许多的副作用。FOXO基因家族，是与脂肪代谢密切相关的，而SIRTl 被证明能够调控这个家族成员的表达，从而达到延长寿命的效果。FOXO基因家族不仅与脂肪代谢密切相关，在动物的繁殖、寿命、肿瘤发生等免疫过程相关的细胞凋亡调控过程中，FOXO 家族成员起重要作用。在哺乳动物体内，FOXO 是SIRT1 的直接和功能性的调控靶点，SIRT1 能够使FOXO3a 和其他FOXO 家族成员发生去乙酰化，进而抑制了其转录调控活力，达到促进存活、抵抗凋亡的作用。SIRT1 还能通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferators activataedreceptor-, PPAR-) 的活性来消耗白色脂肪组织(Whiteadiposetissue, WAT)， 从而降低了体内脂质过氧化积累，这种效应在胰岛素敏感性治疗方面起重要作用6。图1.1 SIRT1 与多种细胞因子相互作用关系网络图白藜芦醇作为SIRT1 的激活剂，通过激活SIRT1 来调控不同信号及代谢途径，从而发挥生物学功能8。SIRT6具有两种酶活性，单ADP核糖基转移酶活性和去乙酰化酶活性，这两个酶功能与SIRT6功能实现有密切关系。与SIRT1相比，SIRT6去乙酰化酶活性较弱，作用底物也较少，这也是为什么SIRT6在被发现几年后其酶活性才得到肯定的原因。衰老的重要表现之一就是基因组不稳定，多项研究表明SIRT6通过促进DNA损伤修复，而具有抗衰老的功能。端粒的长度被用来衡量细胞的衰老程度，随着机体年龄的增加和细胞复制次数增多，锻炼的长度会逐渐缩短。但在永生化的细胞(如肿瘤细胞)中，由于端粒酶的存在，端粒能维持恒定的长度。当把小鼠的SIRT6基因敲除掉以后，小鼠会表现出与人类的Werner综合征相似的衰老特征，Werner综合征的患病原因是一种解旋酶WRN(Werner syndrome ATP-dependent helicase)有缺陷，这种缺失会导致端粒功能障碍，进而使机体表现出与正常年龄不符的衰老特征。此外，当将WI-38细胞中的SIRT6基因特异性敲除后，通过检测发现细胞的分裂能力降低，通过染色发现-半乳糖苷酶表达明显增多，同时还出现端粒功能失调，染色体末端融合等衰老特征。而将端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, hTERT)在SIRT6敲除的细胞中过表达以后，能够促使端粒重新稳定，进而逆转SIRT6基因敲除细胞的早衰症状，从而证明了SIRT6通过维持端粒的稳定来抑制衰老7。1.2.4 SIRT6通过与NF-B作用调控炎症反应和肿瘤发生核转录因子NF-B是在炎症，衰老和凋亡中起着重要作用的转录因子，NF-B信号在衰老的组织器官中表达上调。在应激条件下，与NF-B结合的抑制子IKK(inhibitor of nuclearfactor B kinase)解离，IKK经泛素化降解，而NF-B进入胞核，引起靶基因的表达。目前已知，SIRT6与NF-B的核心亚基RelA存在直接接触，使RelA调控的靶基因启动子部位的H3K9去乙酰化，从而RelA与染色质结合不稳定，最终终止NF-B信号的转录调控作用，抑制靶基因的表达。在SIRT6基因敲除小鼠中，可观察到NF-B信号过度激活，而RelA亚基基因单倍缺失的小鼠却能够逆转由于SIRT6基因敲除而导致的早衰症状，小鼠的寿命也趋近于正常18。这些研究表明SIRT6能通过抑制NF-B炎症信号延缓机体衰老。此外，利用基因芯片进行的研究表明在SIRT6调控的基因和RelA调节的基因中，有很大一部分是相同的，这些基因包括与衰老相关的细胞周期依赖性激酶抑制基因2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, cdkn2a)与Shc1(src homology 2 domain-containing transforming protein C1)等18。衰老的另外一个标志性分子p16随年龄的增长而增多，的原因已被证实与NF-B信号有关。以上研究结果显示，SIRT6和NF-B对炎症反应的调控是通过相互拮抗作用来维持平衡的，进而达到控制衰老进程的目的。众所周知，肿瘤细胞具有与普通细胞不同的特性，具体表现为不稳定的基因组、不可控的细胞增殖等，其在能量供应上也具有独特的特点，可以通过无氧呼吸来提供能量，因此在生存能力上有很强的优势。之前讨论过SITR6在维持基因组稳定、调控糖代谢等方面都发挥重要作用，根据肿瘤的特点，可以推断SIRT6不仅能够调控机体衰老，在肿瘤调控上也有重要作用。2012年，研究发现在对二乙基亚硝胺诱导的小鼠肝癌模型中，发现了SIRT6的重要作用，可以在肝癌的起始阶段发挥重要调节功能。此时癌细胞中转录因子c-Jun可以抑制 c-fos作用，而 c-fos能促进SIRT6的转录，后者通过对组蛋白的去乙酰化调控NF-B，最终抑制survivin蛋白表达，诱导凋亡，抑制起始阶段肿瘤的产生。在肿瘤产生的起始阶段，survivin和c-Jun的高表达也从反面印证了这点。但以上的现象仅发生于肿瘤的起始阶段，对于肿瘤的发展期和末期则不存在，而且c-Jun的促癌作用与抑癌基因P53的关系并不密切19。虚线部分仅存在于肿瘤的形成期，箭头表示促进关系。在应激作用下，机体SIRT6表达上调，通过抑制NF-B信号通路，抑制糖酵解和促 DNA的修复作用，从而抑制肿瘤的形成。NF-B信号通路主要参与促进细胞死亡，炎症和代偿性增生。此外，过表达SIRT6的肿瘤细胞会在P53和P73分别作用下凋亡，然而，其中的作用机制尚不清楚。在肝癌形成早期，c-Jun会抑制c-fos的表达，进而下调SIRT6。图1.2 SIRT6与肿瘤形成的关系1.3 论文构成及研究内容论文包括研究背景、现状分析、研究方案、实验结果、分析讨论、实验结论、参考文献等几个部分。重点是检测手段和对检测结果的分析。试验中对经过不同饲养条件的小鼠的肾脏组织分别进行HE、Masson、PAS、-gal染色，从染色的结果中分析肾脏病理情况以及衰老情况，采用统计的方法对切片结果进行分析；采用Western-blot来检测SIRT6的蛋白量和NF-B的乙酰化水平，通过Real-time PCR来检测Sirt6d的RNA水平，这从分子的角度对肾脏的衰老情况进行了评估，并且尝试着对实验结果进行解释，最后得出白藜芦醇对高脂饮食给肾脏带来的损伤是否有缓解作用，以及对于正常饮食条件下的肾脏组织，白藜芦醇是否有进一步的改善作用。2 研究方案2.1 研究目标衰老一直是人们密切关注的问题，随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始追求更长的寿命和更健康的晚年，于是关于衰老的研究成为了热点。对于衰老的机制，目前有许多观点，更容易被大家接受的是这几种机制混合发挥作用，即网络机制。能够有效延缓衰老的小分子化合物逐渐被人们发现，其中白藜芦醇被多次证明能够有效延缓衰老，防止老年化疾病，但对于具体器官的影响还并不明确，肾脏作为人体中最重要的器官之一，它的衰老会严重影响机体的健康，于是本研究的目的是探究白藜芦醇是否会有效改善高脂饮食引起的肾脏衰老。本试验中采用了高脂饮食、高脂饮食加白藜芦醇、正常饮食、正常饮食加白藜芦醇四种培养方式来饲养小鼠，每组六只。培养三个月后，对每只小鼠的肾脏进行切片染色观察；此外，提取组织的总蛋白和RNA，通过Western-blot和Real-time PCR检测衰老相关蛋白的表达量，采用统计分析的方法得出结论，确定白藜芦醇对高脂饮食引起的肾脏衰老是否有缓解作用，以及是否能够进一步改善正常饮食小鼠肾脏的健康程度，并且进一步从分子角度解释白藜芦醇发挥作用机制，从而为肾脏衰老研究提供靶点，为肾脏疾病治疗药物和保健药物的研究提供依据。2.2 仪器设备、材料、试剂药品的选择（1） 仪器设备：荧光倒置相差显微镜、超净台及其附属器材、4度离心机、冰箱、液氮罐、分析天平、恒温箱、高压灭菌锅、烘箱、微量移液器、磁力搅拌器、手术器械、PH计、恒冷冰冻切片机、生物光学显微镜及U-SPT照相系统、紫外分光光度计医学图像分析系统、PCR仪、酶标仪、电泳装置、转模装置（2） 材料：SPF级的雄性小鼠（SAMP1），三月龄，体重2025克，购自清华大学医学院实验动物平台，通过高脂饮食、高脂饮食加白藜芦醇、正常饮食、正常饮食加白藜芦醇四种培养方式培养三个月，每组各6只（3） 试剂药品：PBS、总RNA提取试剂Trizol试剂盒、BCA扩增试剂盒、DEPC、 酒精、石蜡、二甲苯、苏木精、硫酸、氨水、中性树胶、伊红染色液、Masson复合染色液、5%磷钼酸、苯胺蓝、分化液、半乳糖苷酶染色试剂盒、0.5%过碘酸水溶液、Schiff试剂、偏重亚硫酸纳、蛋白酶裂解液、氯仿、异丙醇、反转录试剂盒（4） 抗体：兔抗小鼠SIRT6多克隆抗体（Cell Signaling Technology公司）兔抗小鼠NF-B p65单克隆抗体 （Cell Signaling Technology公司）兔抗小鼠乙酰化NF-B p65多克隆抗体（香港Abcam公司） 山羊抗兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology公司）2.3 实验内容2.3.1提取小鼠肾脏组织分装保存（1） 将三月龄的小鼠分别在高脂饮食、高脂饮食加白藜芦醇、正常饮食、正常饮食加白藜芦醇四种培养方式下培养三个月，颈椎脱臼处死；（2） 在超净台中，解剖大鼠，取出肾脏组织，预先配好的固定液中，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构；（3） 分割出一部分组织置于离心管中放入80摄氏度冰箱保存，以备提取总蛋白和总RNA。2.3.2 将肾脏组织包埋切片、染色观察2.3.2.1对组织进行包埋、切片（1） 脱水透明：用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精。（2） 浸蜡包埋：将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中，冷却凝固成块。（3） 切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为58微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45恒温箱中烘干。2.3.2.2 对组织进行HE染色（1） 将片子放入二甲苯中脱蜡；（2） 经从高浓度到低浓度的酒精脱水，最后放入蒸馏水中；（3） 放入苏木精水溶液中染色数分钟；（4） 酸水及氨水中分色，各数秒钟；（5） 流水冲洗后入蒸馏水片刻；（6） 入酒精伊红染色液染色23分钟；（7） 蒸馏水冲洗，经酒精脱水；（8） 经二甲苯使切片透明；中性树胶封固，显微镜下观察。2.3.2.3 对组织进行Masson染色（1） 石蜡切片4微米，常规脱蜡至水；（2） Masson复合染色液染色5分钟，蒸馏水冲掉染液；（3） 5%磷钼酸染色5分钟，甩干；（4） 直接用苯胺蓝染色5分钟，蒸馏水稍微冲洗；（5） 分化液分化30-60秒；（6） 无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。2.3.2.4 对组织进行半乳糖苷酶染色（1） OCT包埋的肾组织冰冻切片8微米，室温下晾干2030分钟；（2） 0.1M PBS（PH约为7.0）固定十分钟，PBS冲洗切片；（3） 至于湿盒中，滴加新鲜配置的SA-gal孵育液（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷1mg/ml，40mmol/L柠檬酸缓冲液，5mmol/L亚铁氰化钾，5mmol/L铁氰化钾，150mmol/LNaCL，2mmol/L MgCL2,PH 6.0） 37摄氏度孵育20小时；（4） 流水轻轻冲去染色液，伊红复染2分钟；（5） 自来水冲洗完全，烤片，中性树胶封片，镜检。2.3.2.5 对组织进行PAS染色（1） 石蜡切片4微米，常规脱蜡至水，蒸馏水浸洗1分钟；（2） 0.5%过碘酸水溶液氧化1分钟，蒸馏水洗3次，每次3分钟；（3） 于暗处Schiff试剂染色20分钟，倾去染液；（4） 直接用偏重亚硫酸纳冲洗液冲洗切片2次，每次一分钟，（5） 流水冲洗10分钟，使之显现红色；（6） 苏木素复染细胞核，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。2.3.3 Western-blot检测衰老相关蛋白质含量2.3.3.1 提取组织总蛋白（1） 将组织在冰盒上融化，每个EP管中有大约200mg肾脏组织；（2） 在每个EP管中加入200微升蛋白酶裂解液；（3） 用组织匀浆器搅拌；（4） 在冰盒上裂解30分钟；（5） 4摄氏度离心，10000g，15分钟；（6） 取上清，80摄氏度冰箱保存。2.3.3.2 Western-blot （1） 蛋白质变性：采用BCA法测量蛋白浓度，按照蛋白质含量为50g配置蛋白质混合液，在沸水中变性；（BCA法测蛋白质浓度详细步骤见附录A）（2） 清洗玻璃板：两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干；（3） 配置浓缩胶与分离胶；（4） 灌胶与上样：每个孔加入20ml；（5） 电泳：90V，2.5h；（6） 转模：70V，3h；（7） 封闭液封闭1h;（8） 加入一抗，在室温下摇2h；（9） 洗去一抗，加入二抗；（10） 洗去二抗，加入显色液在暗室显影，分析结果。（详细步骤见附录B）2.3.4 Real-time PCR检测衰老相关蛋白对应RNA含量2.3.4.1 提取组织总RNA（1） 提前用DEPC水处理匀浆器的枪头，以及手术器械，出去RNA酶；（2） 每个EP管大约有200ug组织，每管加入1mLTrizol；（3） 用组织匀浆器将组织彻底搅匀，室温静置5分钟；（4） 加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2分钟；（5） 4摄氏度，12000rpm，；离心15分钟；（6） 将上清移入另外一个离心管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置10分钟；（7） 4摄氏度，12000rpm离心10分钟，去上清；（8） 加入75%乙醇洗涤，4摄氏度，8000rpm离心5分钟，去乙醇；（9） 沉淀用DEPC水溶解，紫外分光光度计测浓度，分装保存与80摄氏度。2.3.4.2 Real-time PCR（1） 搜索近两年发表在nature杂志上的相关文献，查找所需蛋白的qPCR引物序列，托送给引物合成公司合成引物，引物序列如下：m-SIRT6 qPCR117-F CCTGGTCAGCCAGAACGTAGm-SIRT6 qPCR117-R TACTGCGTCTTACACTTGGGAm-GAPDH qPCR104-F CATGGCCTTCCGTGTTCCTAm-GAPDH qPCR104-R CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT（2） 取各样品的1-5 mg总RNA模板，利用Super Script TM III Reverse Transcriptase反转录酶（Invitrogen, USA），将RNA反转录成cDNA后，