高糖对淋巴细胞迁移的影响

单位代码 10006 学 号 10101034 1分类号 Q2 密 级 毕业设计(论文)高糖对淋巴细胞迁移的影响 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物与医学工程 学生姓名次央 指导教师桑晨 2014年 6月 高糖对淋巴细胞迁移的影响次央北京航空航天大学北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：高糖对淋巴细胞迁移的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：动脉粥样硬化是动脉血管的一种慢性炎症反应，在粥样硬化区域能够检测到巨噬细胞和淋巴细的聚集。高糖可促进血液单核细胞向内皮下迁移，而对淋巴细胞的影响研究相对较少，此前的实验我们已经检测到高糖促进淋巴细胞与内皮细胞的粘附，本实验主要检测高糖是否促进淋巴细胞的迁移。 、毕业设计（论文）工作内容：1. 熟练掌握淋巴细胞（Jurkat cell line）的复苏、传代和冻存，配制常用细胞培养液及细胞实验相关试剂； 2. 细胞计数、细胞死亡及增值的检测； 3. 细胞迁移的检测 4. 实验数据的分析和处理 、主要参考资料：1 Zernecke A and Weber C. Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosisJ. Cardiovascular Research, 2010, 86: 192201. 2 Di ME,Gray SP, Jandeleit-Dahm K. Diabetes alters activation and repression of pro- and anti-inflammatory signaling pathways in the vasculature. Front Endocrinol. 2013, 4:68. 3 Grivel JC, Ivanova O, Pinegina N, et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular BiologyJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011,31: 2929-2937. 4 Tse K, Tse H, Sidney J,et al. T cells in atherosclerosisJ. International Immunology ,2013,25; 615622 . 生物与医学工程 学院 生物与医学工程 专业类 101012班学生 次央 毕业设计（论文）时间： 2014年 3月 10 日至 2014 年 6 月 10 日答辩时间： 2014 年 6 月 10 日成 绩： 指导教师： 次央 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室）主任（签字）： 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 页 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：次央签字：时间：2014年 6 月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 页 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 I 页 高糖对淋巴细胞迁移的影响学 生：次央 指导教师：桑晨摘 要糖尿病患者中动脉粥样硬化的患病率和发病率远高于正常人。在动脉粥样硬化形成过程中，白细胞粘附到内皮细胞并迁移至血管壁是早期的重要事件我们此前的实验表明高糖环境能够促进淋巴细胞与内皮细胞的粘附，但高糖环境是否能够促进淋巴细胞迁移的研究并不多。因此，本实验以Jurkat淋巴细胞为研究对象，利用transwell小室，研究高糖是否影响淋巴细胞的迁移。 Jurkat细胞分别在葡萄糖浓度为5.5和22.2mM的培养基中培养24小时，然后将细胞加入到transwell中迁移12小时，随后计数迁移至下室的淋巴细胞数。实验结果显示：不同的糖浓度（5.5Mm和22.2Mm）培养24h对细胞的增值没有明显影响，高糖组迁移的Jurkat细胞显著少于低糖组细胞，其影响机制需要进一步的研究加以明确。关键词：高糖，Jurkat细胞， 迁移北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 IV 页 High Glucose affected Lymphocytes MigrationAuthor: Ci Yang Tutor: SANG ChenAbstract The atherosclerosis prevalence and incidence in diabetes are much higher than normal. During the process of atherosclerosis formation, it is an early and important event that leukocytes adhere to endothelial cells and migrate to the vessel wall. The increased leukocyte and endothelial cell adhesion is likely to promote the atherosclerosis. We observed previously that high glucose can facilitate lymphocytes adhesion to endothelial cells, but it is not clear whether high glucose promote lymphocytes migration. Therefore, in this research, we used the transwell to detect lymphocytes migration under high glucose concentration. Jurkat cells were cultured in the mediums in which the glucose concentrations are 5.5 and 22.2mM for 24hours, then we seed the cells in the transwell for 12 hours migration test, then counting the cells migrated to plate well, we found that the cells cultured in 5.5Mm glucose are more prone to migrate than those in high glucose, the mechanism is not clear, so further study is needed in future.Key words：High glucose, Jurkat cell, Cell migration目 录1绪论11.1 课题背景及目的11.1.1 糖尿病和动脉粥样硬化11.1.2 动脉粥样硬化形机制成21.1.3 白细胞迁移21.1.4 粘附分子和趋化因子31.2国内外研究现状51.2.1 血糖促进动脉粥样硬化发生的可能机制51.2.2 糖尿病和炎症71.2.3 高糖对趋化和粘附因子的影响81.2.4 高糖对内皮细胞影响81.3 论文构成及研究内容111.3.1 研究内容111.3.2 论文构成112 实验方法122.1 实验材料122.1.1 实验所用细胞122.1.2 主要试剂122.1.3 实验常用耗器材122.1.4 实验仪器122.1.5 实验所用各种溶液的配置132.2 方法142.2.1 Jurkat细胞的培养142.2.2 迁移实验152.2.3 数据的统计和分析162.2.4 注意事项163 实验结果与讨论173.1 实验结果173.1.1 不同浓度葡萄糖对Jurkat细胞增殖的影响173.1.2不同浓度葡萄糖对Jurkat细胞迁移的影响173.1.3高浓度葡萄糖条件培养液对Jurkat细胞迁移的影响183.1.4高浓度葡萄糖培养的Jurkat细胞迁移特性的改变203.2 讨论21结论24致谢25参考文献26北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 30 页 1 绪论1.1 课题背景及目的在如今，随着经济高速的发展和工业化进程的加速，威胁人类健康的非传染性疾病日益增重，其中糖尿病和随之而来的合并症因此受到了广泛关注，根据国际糖尿病联盟（The International Diabetes Federation，IDF）的统计，2000年全球糖尿病患者为1.51亿人，目前这个数字已上升到2.85亿，预计到2030年，全球糖尿病患者的数量将达到5亿1。近30年来，我国糖尿病患病率有明显的上涨趋势，从1993年开始，糖尿病的发病人数在逐年增加，最新调查结果显示我国2009年的糖尿病患者比2008年上涨6.5倍2。国内近年来的各项大型调查也显示，中国糖尿病患病率呈逐年持续快速增长趋势，有一项调查显示，我国糖尿病标化患病率已达9.7%，相当于每 10 个成年人中就有一个糖尿病患者，而糖尿病前期的比例高达15.5%，相当于每 67 个成年人中就有一个高血糖状态者3。糖尿病可分为两类：1型糖尿病，也被称为胰岛素依赖型糖尿（insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM），通常是因为先天性的自身免疫损伤胰岛致使胰岛素分泌不足形成的；2型糖尿病，被称为非胰岛素依赖型糖尿病（noninsulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM），是多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴随着因胰岛素分泌减少或功能障碍引起的糖、脂肪和蛋白质代谢的异常。1.1.1 糖尿病和动脉粥样硬化研究表明糖尿病可引发包括动脉粥样硬化在内的多种并发症，糖尿病患者患心血管疾病的风险高于普通人的，糖尿病相关的死亡大概有80%是因为心血管疾病引起的4。在这么多的并发症之中，2型糖尿病易于导致动脉粥样硬化的因素是多方面的，包括多种代谢综合征，例如高脂血症、高血糖症、高血压和肥胖（尤其是腹部肥胖）。肥胖同时也会引起高脂血症和高胆固醇血症的发生，在经典动脉粥样硬化斑块的形成过程中高脂血症和高胆固醇血症与之存在着密切的关系5。但是目前糖尿病所导致动脉粥样硬化的原因并没有完全的明确。1.1.2 动脉粥样硬化形机制成动脉粥样硬化主要是发生在大中型动脉内膜和中膜内层，出现了脂质沉积、坏死从而形成粥样物，同时存在纤维组织和平滑肌细胞的增生，表现为动脉管壁增厚、变硬，以及弹性减弱和管腔缩小。关于动脉粥样硬化的形成机制存在多种假说：第一种是修饰脂蛋白的多种组分，其中的LDL 氧化产物像氧化磷脂、醛类和溶血磷脂酰胆碱均有导致炎症发生的作用，它们会使白细胞聚集，诱导组织因子和基质金属蛋白酶的表达等等。在动脉粥样硬化的患者和动物模型都已经得到了证实6，就是氧化的LDL 可以诱发体液和细胞免疫的发生，抗氧化型的 LDL 抗体滴度和颈动脉粥样硬化的发展也有一定的相关。第二种是多种感染因子其中包括巨细胞病毒、肺炎衣原体和幽门螺旋杆菌，不管是对病灶内病原菌的检测还是流行病学研究都已经证实了这些病原菌和动脉粥样硬化发生发展有关系。第三种有的人认为动脉粥样硬化的炎症反应来源于自身的免疫，它的抗原可能包括氧化型的 LDL 和肺炎衣原体或者是内源性热激蛋白(heat shock proteins,HSPs）7。目前众多研究者倾向于认为动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症过程，在此过程中血液中单核细胞和淋巴细胞、血管内皮细胞以及血管壁中膜的平滑肌细胞均可能发挥重要作用。血液中的白细胞粘附于血管内皮并越过内皮细胞迁移至内皮下层是这一反应的早起但关键步骤。除动脉粥样硬化外，感染性疾病、肿瘤转移等多种疾病的发生以及它们的发展都和细胞跨内皮迁移有着密切的关系。在动脉粥样硬化的形成过程中，泡沫细胞的形成也被认为动脉粥样硬化一个始动因素8。单核细胞和血管内皮发生黏附以及随后发生的跨内皮迁移是形成泡沫细胞的前提9。单核细胞迁移到内皮细胞下之后，受到内皮下脂蛋白的刺激, 逐渐分化为胞内含有大量脂质成分的泡沫样的巨噬细胞，大量的泡沫细胞聚集形成动脉粥样斑块，同时泡沫细胞进一步了刺激血管平滑肌细胞的增生，逐渐形成了动脉粥样硬化条纹10 。1.1.3 白细胞迁移血液中的白细胞或者组织中的巨噬细胞在趋化因子作用下能够向趋化因子浓度高处迁移，进而发挥吞噬作用或者分泌细胞因子等活性物质。在白细胞迁移过程中，白细胞自身或者其他细胞分泌的趋化因子及白细胞膜上表达的趋化因子受体发挥重要的调节作用。白细胞的跨越血管内皮由血管迁移至外周组织的存在不同的方式，其中在外周血管组织中白细胞主要是通过跨越内皮细胞的连接部位进行迁移（paraendothelial migration）,例如在外周组织血管（比如像毛细血管后微静脉）内皮细胞连接比较疏松，细胞很容易通过内皮细胞的连接部位，白细胞主要通过跨越该部位进行的迁移，另外一种迁移的方式是穿细胞迁移（transendothelial migration）。例如在血管内皮细胞连接比较紧密的部位（脑组织的微循环，特别是血脑屏障），细胞大多则是通过穿越内皮细胞胞浆的方式进行的迁移。白细胞无论以哪种方式穿过内皮细胞，均有粘附分子及趋化因子的参与和调控。1.1.4 粘附分子和趋化因子粘附分子是一类能介导细胞间粘附的糖蛋白11。根据分子结构的不同为三类；免疫球蛋白超家族（ immunoglobulin superfamily），其中包括细胞间粘附分子（inter cellular adhesion molecular-1，ICAM-1、inter cellular adhesion molecular-2，ICAM-2），血管细胞粘附分子（vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1 ）。整合素家族（Intergrin family） 由链和 链组成的异二聚体结构，包括迟发性抗原1-6 （VLA 1-6），粘附分子1 （Mac-1），P150, 95 （CD11c/ CD18），LFA-1 等。选择素超家族(Selectin superfamily)包括L-选择素(CD 62 l)、P-选择素(CD 62 p) 和E-选择素(CD 62 e)，内皮细胞紧密连接处（PECAM，VE-cadenin和CD99）在白细胞穿越内皮细胞间隙时发挥重要的调节作用12。 趋化因子和粘附分共同作用于淋巴内皮细胞之间以及基质，共同完成炎症过程中淋巴细胞的募集或者是粘附。趋化因子是细胞因子，现目前为止已经发现趋化因子有 50 多种，根据两个半胱氨酸残基（C）在结构中的数量以及不同的位置，可将趋化因子分为四类CXC ，CC ，C以及CX3C 。CXC 趋化因子已经被证明表达在T淋巴细胞，包括白介素淋巴细胞，基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor 1，SDF -1），白介素-8（Interleukin 8 Interleukin 8 Interleukin 8 Interleukin 8，IL -8），干扰素- 生产因子-10 （Interferon gamma-induced protein 10 ，CXCL10 /IP -10 ）。 CC趋化因子的趋化范围则适用于T细胞以及单核细胞，包括调节活化蛋白（regulated on activation, normal T cell expressed and secreted，RANTES / CCL5），单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein -1，CCL2 /MCP -1），巨噬细胞炎性蛋白-1（Macrophage inflammatory protein 1，MIP-1/CCL4 1）和MIP-3。这些趋化因子主要用来趋化和活化T淋巴细胞的， 对T淋巴细胞的募集有着十分重要的作用13。其中，MCP -1在不同程度的调节T淋巴细胞上的1 和2 整合素，介导整合素依赖的淋巴细胞与内皮粘附分子或外基质组结合。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的GTP-蛋白偶连的跨膜受体（GPCR），通常表达在内皮细胞、免疫细胞等细胞膜上。分子由约330个氨基酸组成。7个跨膜区将分子分成细胞外自由的N一端、3个细胞内环、3个细胞外环以及C一端几个部分。胞内第二环是和异三聚体G蛋白偶连的部位，有特征的天门冬氨酸一精氨酸一酪氨酸盒（DRY box）氨基酸序列。与趋化因子受体偶连的异三聚体G蛋白的a亚基为Gi/o，对百日咳毒素敏感。按趋化因子的分类，将同CC类趋化因子结合的受体称为CC类受体（CCR），同CXC类趋化因子结合的受体称为CXC类受体（CXCR），同样有C 和CX3C 受体（CR、CX3CR）14。对于趋化因子在配体-受体结合实验中，可以得到趋化因子与受体间结合的存在冗余，即一个趋化因子可与许多个趋化因子受体结合，例如RANTES与CCR1、CCR3、CCR5的结合；一个趋化因子受体也可以同数个趋化因子结合，如CCR3与eotaxins，RANTES，MCP-2、3、4的结合15。因此，在体外趋化实验中表现为，一种趋化因子可以趋化表达不同趋化因子受体的免疫细胞做定向迁移，一种免疫细胞可以为多种趋化因子所趋化。正是这种趋化因子及其受体相互作用的冗余才使趋化因子系统在体内的精细调控成为可能。在体内，趋化因子受体在不同免疫细胞类群上不同时相的表达和分布差异，各种趋化因子通过它们在组织中不同时相的表达和分布是存在差异的，调控着不同免疫细胞的定向迁移和相互作用，并由此决定了趋化因子与其受体作用的特异性。趋化因子的基本功能就是对表达有相应趋化因子受体的细胞的定向趋化作用。目前认为，免疫细胞克服血管内皮细胞屏障，在体液和组织间穿行包括4个步骤，即细胞随体液流动、细胞被稳固黏附到血管内皮上、细胞穿过内皮细胞间隙、细胞迁移到特定组织中。在此过程中，趋化因子控制着渗出细胞的选择性以及被选择细胞的稳固黏附。体外实验已证实趋化因子能使在血流速度下的淋巴细胞黏附在固相支持物上，不同的趋化因子特异地引导表达相应趋化因子受体的淋巴细胞的附着16。免疫细胞由于所表达的选择素与血管内皮细胞上的选择素受体的相互作用，与血管内皮有瞬间的非选择性的可逆性黏附，因此免疫细胞在血流中沿血管壁做滚动前行。局部组织中血管内皮细胞所分泌的趋化因子通过内皮细胞上的GAG被富集在血管内皮表面17，表达相应趋化因子受体的免疫细胞在滚动前行中由于与血管内皮上趋化因子作用而促使免疫细胞整合素的上调，整合素与内皮细胞上的黏附分子的相互作用导致免疫细胞不可逆地黏附到血管内皮表面。稳固黏附的免疫细胞在其分泌的特殊酶的作用下，穿过内皮细胞间隙和基底膜，并在趋化因子浓度梯度的引导下，移行至特定组织中，趋化因子除了对免疫细胞有定向趋化作用外，对其它能够表达相应趋化因子受体的组织细胞都具有趋化作用。只是对于组织细胞的趋化还有很多方面的不清楚。1.2 国内外研究现状1.2.1 血糖促进动脉粥样硬化发生的可能机制国内外多数研究者认为动脉粥样硬化是一种动脉壁炎症性疾病，包括内皮功能异常，白细胞粘附于内皮细胞及迁移至内皮下组织（图1.1）。在一些危险因素如高血糖、高血压、高胆固醇血症、吸烟和高纤维蛋白原血症等的影响下，血管内皮功能出现异常，各种粘附分子、炎症趋化因子表达增加，促使炎症细胞（主要是单核细胞和T-淋巴细胞）向动脉内膜迁移。在临床及尸检资料中表明18，高血压患者动脉粥样硬化发病率明显比正常人高。这可能是因为在高血压的时候，动脉壁承受了特别高的压力状况，内膜层和内皮细胞层因此受到了损伤，因而低密度脂蛋白更加容易的进入动脉壁，并且刺激了平滑肌细胞的增生，从而引发了动脉粥样硬化。另一方面就是对于高血脂症，在临床的资料显示，动脉粥样硬化常见于高胆固醇血症。实验动物在高胆固醇饲料的饲养下，最终可以引起动脉粥样硬化。近年来的研究同时也发现低密度脂蛋白和极密度脂蛋白的增高和高密度脂蛋白的降低都同动脉粥样硬化是有联系的。血液中的甘油三酯的增高与动脉粥样硬化的发生也有联系。最新的研究发现脂蛋白aLpa）与动脉粥样硬化的发生有密切关系19。而对于糖尿病者多数都有高胆固醇血症或高甘油三酯血症，有的还存在高血压，因此使动脉粥样硬化的发病率明显增高。糖尿病者还因为有血液的第因子的增高和血小板活动性能的增强。因为血液中的第因子是由动脉壁内的细胞产生的，这种因子的增高表现出了内膜的病变，而血小板活动增加会让血小板很容易在动脉壁上聚集，加快了动脉粥样硬化血栓的形成同时引起了动脉管腔的闭塞。一些研究者认为胰岛素抵抗同动脉粥样硬化的发生有关系非常密切，2型糖尿病病人常常会有胰岛素抵抗和高胰岛素血症伴发冠心病20。因此探究糖浓度对免疫细胞迁移的影响有助于了解糖尿病患者易患动脉粥样硬化的机制，进而找寻对应方法。图1.1：血管动脉粥样硬化的形成机制。血管病变导致内膜增生，apo-E在血管内皮下累积，单核细胞粘附于内皮细胞并向内皮下迁移，聚集分化形成巨噬细胞，巨噬细胞大量摄取ox-LDL并转化为泡沫细胞，向内皮细胞迁移形成早期动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化的进一步发展，可导致血栓的形成。2型糖尿病所致动脉粥样硬化为多因素作用，单核细胞在内皮下聚集并分化为巨噬细胞，继而吞噬氧化型低密度脂蛋白，形成泡沫细胞，最终形成粥样斑块。动脉粥样硬化的形成，主要是内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞与平滑肌细胞相互作用造成。单核细胞在血管内皮细胞下形成泡沫细胞，泡沫细胞凋亡或坏死并释放脂质进而形成细胞外脂核，有纤维帽覆盖脂质核心（胆固醇和胆固醇酯）上，随着脂核的逐渐增大、纤维帽的变薄以及巨噬细胞的增多，一些细胞因子如肿瘤坏死因子、白介素-6、干扰素和基质金属蛋白酶等参与炎症和斑块分解作用，可导致斑块破裂，继而活化血小板和形成血栓，造成血管狭窄或闭塞21.因此，免疫细胞的迁移是动脉粥样硬化形成的关键环节。以往的研究发现，高糖能降低人脐静脉内皮细胞，人肺动脉内皮细胞的粘附和细胞增殖，因而在糖尿病人中常出现伤口愈合缓慢及动脉粥样硬化的加剧。针对这一现象， Hamuro 等22研究发现高血糖能诱导核因子-B ( nuclear factor kappa B, NF-B)的活性从而抑制内皮细胞迁移，内皮细胞迁移在动脉粥样硬化的发生和发展中的作用主要表现在两个方面， 即内皮细胞受损后的再内皮化和动脉粥样硬化斑块内的血管新生(angiogenesis)23。多种因素会对内皮细胞造成损伤，在动脉粥样硬化早期, 内皮细胞的脱落被认为是重要的原因之一。这些裸露区的大小及存在的时间对于血小板和淋巴细胞的黏附可能有着重要的影响。对于在动脉粥样硬化中其高糖浓度对内皮细胞的影响已经有很多研究，由这些研究可知，细胞间粘附分子l系免疫球蛋白超家族成员，其sICAM-l是ICAM-l的可溶性形式的存在，是由ICAM-l的膜外段脱落形成的。细胞间粘附分子l主要表达于血管内皮细胞，它可以通过与其配体-淋巴细胞功能相关抗原l和巨噬细胞抗原复合体l相结合，介导白细胞与血管内皮细胞的粘附与浸润，是动脉粥样硬化的早期事件和始动环节24。许多研究表明，sICAM-l升高与大血管病变有关，而在糖尿病病人体内sICAM-l会显著地升高并且伴随着血管的病变。1.2.2 糖尿病和炎症目前的研究表明，主要因为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和胰岛素分泌不足是2型糖尿病的发病机制，长期IR的不足不仅会造成B细胞功能衰竭，让血糖升高，也会对糖尿病的大血管病变发生发展存在着重要的影响。另外的研究发现在炎症的急性时相蛋白中最敏感的指标是C反应蛋白(C-RP)，它和IR有着密切关系，它的增高揭示了糖尿病大血管并发症的炎性反应机制，对糖尿病风险预测及临床治疗效果的评估具有一定的价值。C-RP与冠状动脉疾病、动脉粥样硬化的发生和发展以及其后有着非常密切联系。在生物学因子众多中反映低度炎症反应的C-RP是临床上最为常用的一个指标。它主要是由前炎症因子白细胞介素6(IL-6)在刺激下肝脏合成的急性时相反应蛋白25。是作为血浆的一个成分存在的，则在不同的炎症刺激下，血浆中的C-RP水平会有显著而且快速的变化，炎症反应的时候相涉及的程度和C-RP增高的发生率增高值可能有关。1.2.3 高糖对趋化和粘附因子的影响动脉粥样硬化是糖尿病大血管并发症的主要病变。动脉粥样硬化早期病变形成过程中，MCP-1等趋化因子和ICAM-1、VCAM-1等粘附分子起了重要作用26。MCP-1是血管内皮细胞表面介导单核细胞向内皮下间隙迁移的趋化因子27。ICAM-1和VCAM-1是血管内皮细胞表面重要的粘附分子，ICAM-1主要介导中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞与内皮细胞的粘附迁移，VCAM-1主要介导单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与内皮细胞的粘附迁移。研究表明，MCP-1、ICAM-1、VCAM-1等炎性因子过量表达是冠状动脉疾病早期的预报器28。血管内皮细胞功能紊乱在糖尿病血管并发症发生发展中起了重要作用29。在糖尿病及合并冠状动脉血管病变或合并肾病、视网膜病变等微血管病变中，血浆中MCP-1、ICAM-1、VCAM-1含量显著增加，而高血糖是主要的危险因素之一30。高糖对内皮细胞粘附分子的上调作用可能与其自身氧化产生的过多活性氧自由基造成的过氧化压力增加有关，与蛋白激酶C（protein kinase C，PKC） 、核转录因子NF-B及p38MAPK机制相关。寻找可抑制内皮细胞粘附分子过量表达、改善内皮细胞功能的药物对防治血管内皮细胞功能障碍性疾病具有深远的影响31。糖尿病患者的内皮功能失调导致冠脉和外周侧支血管供血不足，而骨髓、外周血和脐血中存在能进一步分化成为内皮细胞并参与血管新生的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs），高糖可减少EPCs数量，也可以显著的抑制外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力，并呈现出浓度和时间依赖性，这为糖尿病侧支血管形成受损机制提供了体外实验依据，说明了糖尿病患者血管形成能力低下至少部分是由于高血糖抑制了EPCs的数量和功能所致。而Schatterman32发现，输注外源性EPCs能改善糖尿病小鼠的血管形成能力，促进糖尿病小鼠缺血肢体的血流的恢复，因此说明了对于糖尿病患者严格控制血糖即能改善EPCs功能，从而改善其血管形成能力，并且可以通过体外输入EPCs是有效解决糖尿病病变的方法。1.2.4 高糖对内皮细胞影响糖尿病因伴有严重的大血管和微血管并发症而造成患者死亡率增加，其中内皮细胞(EC)功能损害是血管病变起始的关键因素之一。高血糖是糖尿病患者独有的检测指标，高血糖对内皮细胞具有影响，血管早期损伤机制说明情况有助于延迟或阻止糖尿病血管损伤的发生。我们查阅的文献中高浓度葡萄糖（Glu）的培养液培养血管内皮细胞以后33，观察到内皮细胞的增生和黏附分子表达，实验中在对照组（5.5Mm）培养的细胞和不同的三组高糖浓度（11.2Mm,16.8Mm，33.6Mm）下培养的内皮细胞的生长情况的结果为：在24h的时候，三组高糖下的细胞的生长情况都是上升的情况，在72h的时候细胞的生长出现了停滞的现象，其细胞的死亡率明显的大于对照组死亡的细胞。对于内皮细胞的受体的表达的结论：内皮细胞在三组高糖培养的内皮细胞的血管细胞的粘附分子-1（ICAM-1 ）在48 h和72h后表达都有明显的上升趋势和对照组相比较，但是在三组高糖培养的内皮细胞的血管细胞的粘附因子-1（VCAM-1）和对照组VCAM-1的表达没有明显的差异存在。糖尿病是导致动脉粥样硬化内皮功能损害的主要原因，在动脉粥样硬化早期，单核细胞与血管内皮细胞黏附、迁移起到始动作用，细胞之间、细胞与基质之间相互黏附和相互作用贯穿了动脉粥样硬化的整个病理过程。在这个过程中，白细胞的黏附是由黏附分子如ICAM-1、VCAM-1在内皮细胞表面诱导下完成的。很多的研究中指出了，在临床发现伴有心血管和微血管并发症(视网膜病变、肾脏病变)的糖尿病患者，它们的VCAM-1的水平高于无并发症的糖尿病患者和正常人，同时对VCAM-1进行各种刺激也会使其的表达增加。因此对于VCAM-1的表达是否完全依赖于血糖的浓度没有得到确切的证实。只是证实了ICAM-1、VCAM-1的表达会随着葡萄糖浓度的升高而增加34。另外根据文献的记载35，长期在高糖环境下的大鼠中的血浆NO2-含量和cGMP含量减少，表明高糖可以严重的损伤血管内皮功能。血管内皮释放的内皮舒张因子(Endothelium-derived relaxing factor，EDRF/NO)在维持血管正常功能中起重要的调控作用。血管组织中含有两种NOS、诱导型NOS（iNOS）主要存在于VSMC中， 固有型NOS（cNOS）主要存在于内皮细胞中。NO以旁分泌/自分泌方式作用于VSMC膜上的鸟苷酸环化酶，使其活化，细胞内cGMP水平升高，胞装Ca2 减少，引起血管舒张。NO除作为舒张因子外，还是内源性VSMC增殖抑制剂，参与维持VSMC收缩表型的作用。此外，长期高糖血症，内膜受损，可激活血小板，释放血小板衍化生长因子，刺激VSMC增殖。实验还表明了高糖组的血清胰岛素含量增高，从而会使胰岛素出现抵抗，长期高胰岛素可以促进VSMC的迁移、增殖和肥大。高糖组的血脂成分也升高，尤其是胆同醇升高，说明高糖血症引起了继发性高脂血症。胆固醇脂代谢失调可促进PDGF等因予释放并加速对低密度脂蛋白一胆固醇的摄取，抑制游离胆固醇的外流。因此根据本实验结果可认为，长期高糖血症可致EDRF/NO系统功能障碍，胰岛素及其他生长因子含量增多，脂代谢紊乱，从而使血管内皮功能受损，促进了VSMC增殖，在动脉粥样硬化（AS）性血管并发症的发生发展中起重要作用36。对于高糖对单核细胞的影响，研究指出37。趋化因子1（MCP-1）介导单核细胞与血管中的内皮细胞粘附，通过促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，影响脂质的代谢，增加细胞间质胶原的合成参与动脉粥样硬化的形成。实验中正常大鼠的MCP-1的蛋白表达非常的弱，但是具有2型糖尿病的大鼠中的MCP-1的表达明显的增加。实验结果：高糖血症通过血管内皮细胞中的P38MAPK、POS敏感信号通路加速了血管内皮细胞的MCP-l的分泌和MCP-lmRNA表达，并且有时间上的依赖。MCP-1可使血管壁的单核细胞转变为巨噬细胞，吞噬大量的修饰脂蛋白，形成泡沫细胞，粘附并浸润动脉壁，这样可以形成动脉硬化。活化的白细胞和血管壁本身的细胞又释放多种生长因子，促进血管平滑肌细胞的增生，刺激炎症产生，加重了动脉硬化的形成38。胰岛B细胞也能分泌高水平的MCP-1，并对单核/巨噬细胞产生趋化作用使炎症细胞向胰岛细胞渗透，释放一系列炎症因子，启动炎症反应，导致胰岛炎症，破坏胰岛细胞，功能减退。高糖能刺激成纤维细胞、SMC、内皮细胞等合成和分泌MCP-1。李艳波等39用高糖培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，加入葡萄糖25mM后，孵育72 h，MCP-1表达增加。高糖可激活细胞NF-B，进而影响MCP-1的表达。Lee等41用等量等浓度的葡萄糖和甘露醇分别培养腹膜内皮细胞7 d，经NorthernBlot和酶联免疫吸附检测到葡萄糖培养使MCP-1mRNA表达水平和MCP-1蛋白水平明显升高，而同浓度的甘露醇没有类似现象。高糖能刺激氧自由基的形成，后者通过NF-B上调MCP-1的表达。长期高血糖亦导致内皮细胞功能失调，缩血管物质释放增多，黏附分子表达增多，增加单核细胞在血管内膜下的聚集，促进动脉粥样硬化的形成。我们此前的实验也观察到高糖环境能够促进淋巴细胞与内皮细胞的粘附，但高糖环境是否能够促进淋巴细胞迁移的研究并不多。因此，本实验以Jurkat淋巴细胞为研究对象，利用transwell小室，研究高糖是否影响淋巴细胞的迁移。1.3 论文构成及研究内容1.3.1 研究内容不同浓度葡萄糖培养液对淋巴细胞增值的影响；不同浓度葡萄糖培养液对淋巴细胞迁移的影响；1.3.2 论文构成本论文由研究背景、研究方法、实验结果和讨论的几部分构成。2 实验方法2.1 实验材料2.1.1 实验所用细胞实验所用细胞为人淋巴瘤细胞株Jurkat cell line，在体外实验中可作为T淋巴细胞株使用。细胞培养液： RPMI1640+10%FCS+1%PS，青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml。培养于5%CO2，37oC细胞培养箱中。2.1.2 主要试剂(1)常用试剂RPMI 1640 培养基：Sigma，美国胎牛血清：四季青，杭州青霉素（10000units/ml）：Sigma，美国链霉素（10000g/ml）：Sigma，美国胰蛋白酶： Ameresco，美国二甲基亚砜（DMSO）：Sigma，美国氯化钾（ KCl ），磷酸二氢钾（ KH 2PO 4），氯化钠（ NaCl ），磷酸氢二钠（Na2HPO4）， 购自北京化学试剂厂。2.1.3 实验常用耗器材T25培养瓶：Corning ，美国 24孔板：Corning，美国 Transwell小室：Greiner，德国离心管和无菌枪头2.1.4 实验仪器普通倒置光学显微镜：ELWDN.A.0.30，Motic AE31公司，日本pH计：pH/ISEmeter-86805，ORION公司，美国超纯静水器：KQ250E，Utrawave Wash Machine公司，北京 恒温磁力搅拌器：85- 2型，司乐仪器有限公司，上海电子天平： Sartorius公司，德国高压灭菌箱： ALP公司，日本直热式二氧化碳培养箱：Thermo Form公司，美国-80 oC 冰箱：Thermo Form公司，美国离心机（室温离心机） ：中国2.1.5 实验所用各种溶液的配置（1）RPMI 1640培养液：一袋RPMI 1640粉末，加2.0 g碳酸氢钠，三蒸水溶解，调节pH至7.4，定溶至1000ml，过滤除菌后分装。（2）10% RPMI 1640完全培养液：在RPMI1640的培养液加入灭活的10%胎牛血清，另外添加青-链霉素5.5ml（培养液中浓度：青霉素100 units/ml， 链霉素100g/ml），无菌条件下配制，充分混合均匀于 4oC保存。（3）胎牛血清：购买的瓶装血清，在使用前进行灭活，首先将冻存的500mL 瓶装血清放置于37 oC水浴锅中化冻，然后将水浴锅温度调至56oC灭活30分钟后于无菌条件下装， 并标记20oC储存。（4）细胞冻存液：完全培养液、胎牛血清、DMSO按6:3:1比例于冻存前配置。（5）PBS缓冲液（pH 7.27.4） 用电子天平称取氯化钠 8g 、氯化钾 0.2g 、磷酸二氢钾 0.27g 、磷酸氢二钠 1.42g 放入烧杯，加去离子水800 毫升，用玻璃棒或者振荡器使溶剂充分解然后加入盐酸，调节pH为7.4 ，最后定容到1L 。用高压锅温灭菌，待恢复常保存至4oC冰箱备用。（6）高糖和低糖培养液高糖（22.2Mm）：50mlRPMI 1640（无糖）+10%胎牛血清+400l葡萄糖低糖（5.5Mm）：50mlRPMI 1640（无糖） +10%胎牛血清+100l葡萄糖（7）0.25% 胰蛋白酶的配置用电子天平称取 0.25g 胰蛋白酶粉末，放入100ml PBS中，胰蛋白酶完全溶解后在无菌条件下用 0.2m滤器过滤，并且分装标记置于 -20oC保存备用。2.2 方法2.2.1 Jurkat细胞的培养（1）细胞冻存（慢冻） 选对数生长期细胞，在收集细胞前24h换液，离心收集细胞并用新配置的冻存液重悬。密度为1106/m，每冻存管中放11.5ml，做好标记，在4 oC 1h，-20oC 1h，-80oC过夜后迅速放入液氮罐中长期保存。Jurkat冻存时细胞数易控制在510106/ml，冻存细胞数过少则不易复苏。（2）细胞复苏（速溶） 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37 oC水浴中（1-2分钟），其冻存管里的冻存液融化差不多还有小许的冰取出后将其加入到10倍体积的PBS中离心（800r/min，5min），将上清去掉，加入完全培养液重悬细胞，进细胞转入培养瓶中，放在37oC，5%CO2次日再进行换液。细胞复苏的过程是需要非常迅速的，Jurkat细胞刚复苏时死细胞较多，可按1:2传代34次，此时细胞生长状态良好。 （3）细胞传代细胞的生长状态良好后，进行细胞传代，在进行30分钟灭菌的操作台上，将T25中的液体轻轻的摇晃，使其细胞得到充分的均匀，用1ml的无菌抢头取出0.5ml或者1ml放到新的T25培养瓶中，并且加入新的10% FBS的RPMI 1640完全培养液使其达到5ml，置于37oC，5% CO2培养箱中培养，经过2-3天的培养，细胞长到致密状态的时候，在进行传代。（4）低糖和高糖环境下的培养将生长状态良好的Jurkat淋巴细胞进行细胞计数，然后分别取出细胞的密度为1105/ml的细胞放在15ml的移液管进行（800r/min，5min）的离心，并将上清液去掉，分别加入1ml的低糖和高糖的培养液进行细胞的重悬过程，分别拿出两个T25的培养瓶加入4ml的低糖和高糖培养液，在将15ml移液管中的1ml低糖和高糖分别再到T25的培养瓶中，置于37oC，5%CO2培养箱中进行24h的培养2.2.2 迁移实验(1)确定迁移时间Jurkat细胞分别在低糖和高糖培养液中培养24小时，收集细胞计数后离心然后以新鲜培养液重悬细胞，各取500l培养液（上清）放入24孔培养板中（下室），将transwell（上室）置入24孔板，此时transwell底面刚好接触下室中培养液，上室内分别加入低糖和高糖培养的Jurkat细胞200l，细胞总数为5104个，24孔培养板置于细胞培养箱中，每隔2小时光镜下观察Jurkat细胞迁入下室情况，12h后细胞开始迁移至下室，以后实验中将迁移时间设置为12h。（2）迁移实验不同浓度葡萄糖条件下的迁移：Jurkat细胞在5.5和22.2mM葡萄糖培养液中培养所需时间，收集细胞离心并计数，分别取500l培养液放入24孔板，各取新鲜培养液重悬的Jurkat细胞1105个加入上室transwell中，迁移12h，光镜下随机选取9个10倍镜视野计数，并行2孔，实验重复3次。 高浓度葡萄糖培养不同时间后的迁移：Jurkat细胞在22.2mM葡萄糖培养液中分别培养12、24、48h，收集细胞离心并计数细