高美华《医学免疫学》elisa.ppt

医学免疫学实验（三） 免疫标记技术,张蓓,检测Ag-Ab的体外实验,1,2,3,凝集反应,沉淀反应,免疫标记技术,标记免疫技术=,灵敏性,特异性,免疫技术+标记技术,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,分 类,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,ELISA 原理及特点,特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。,原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,酶联免疫吸附试验（ELISA） 双抗体夹心法（双位点一步法）测甲胎蛋白（AFP）,【临床意义】 significance in clinical practise,1、原发性肝癌的大规模普查,2、可以用作检测胎儿畸形和畸胎瘤,一、ELISA双抗体夹心法测AFP原理,用抗AFP抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中的AFP与固相载体上的抗体结合，再加入酶标记的抗AFP抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加底物显色，颜色的深浅与相应AFP的量呈正相关。 双位点一步法：包被抗体和酶标抗体分别是抗AFP不同位点的McAb,ELISA 原 理 图,【实验原理】 Experiments mechanism,principle,抗AFPMcAb抗体,抗AFPMcAb抗体,AFP,双位点一步法：抗AFP不同位点的McAb,二、试剂材料,1、AFP检测试剂盒 2、AFP参考标准液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。 3、DW 4、终止液（2M H2SO4）。 5、酶标测定仪、37温箱。 6、微量加样器、滴管、吸水纸等。,三、method,（一）quantity test 1、add sample 取包被好的酶标孔7孔，进行标记，第16孔分别加入AFP参考标准夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）各100ul。第7孔加入样品100ul。3720分钟 2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。 4、wash 5、显色 每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。 5、酶标仪450nm比色，计算结果。,（二） quality test 1Add sample 取包被好的酶标板3各孔，分别加入阴性对照（25 ng/ml）、阳性对照（400 ng/ml）和待检标本各100ul 3720分钟。 2、wash：在各孔中加入洗液2滴,轻轻摇动几下,弃之,然后用蒸馏水或自来水加满各孔,甩掉,反复5次,最后在吸水纸上拍干. 3、每孔加酶结合物2滴，3715分钟。 4、wash 5、显色 每孔加底物和显色液各1滴，轻轻振摇，室温避光反应5分钟，加入2滴终止液终止反应。,四、result,1Quantity test 用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，AFP含量为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出相应标本的AFP含量。 2Quality test 在白色背景上直接肉眼观察结果。阴性对照孔应基本无色，阳性对照孔呈深蓝色。若待检样品孔色泽深于阳性对照孔则AFP400ng/ml，阳性；若待检样品孔色泽深于阴性对照孔而浅于阳性对照孔则20ng/mlAFP400ng/ml，弱阳性；待检样品孔色泽浅于阴性对照孔则AFP 20ng/ml，阴性。 参考范围：正常成人AFP含量20ng/ml。,【实验结果】 Experiments results,若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为 若待检孔显色深于或