小建中胶囊质量标准的建立与完善.doc

小建中胶囊质量标准的建立与完善【摘要】 目的建立并完善小建中胶囊(白芍，生姜、甘草等)的质量标准.方法采用TLC法鉴别小建中胶囊中桂皮、白芍、甘草、生姜;HPLC法对制剂中的芍药苷进行含量测定( C18柱，甲醇-水(19：81)为流动相;检测波长为230 nm)。结果TLC法均能对桂皮、白芍、甘草、生姜进行专属性定性分析;含量测定芍药苷的线性范围为：0.432.15 g /ml(r=0.9999)，线性关系良好。平均回收率为99.79%(n=6) ，RSD为1.1%。结论所建立的方法可准确地进行定性和定量检测，方法可靠、简单，重现性好。 【关键词】 小建中胶囊; 质量标准; 芍药苷; 高效液相色谱; 薄层色谱小建中胶囊由白芍、桂枝、炙甘草、生姜等6味药组成，具有温中补虚，缓急止痛的功效;用于脾胃虚寒，脘腹疼痛，喜温喜按，嘈杂吞酸，食少，心悸;胃及十二指肠溃疡。为中国药典2010版部新增中成药品种，原标准为新药转正标准第二十七册WS3-209(X-199)-2000(Z)，方中生姜具有温中散寒的作用，且投料量较大，但无生姜的鉴别，其桂枝、甘草的TLC法鉴别操作烦琐、提取时间长，且甘草鉴别重现性差，甚至不出现斑点 ;含量测定的提取较为复杂，为了对本品进行更好的质量控制，本文通过此次标准提高行动对其标准进行了修订，并增加了生姜的TLC鉴别。1 仪器与材料1.1 仪器与试药日本岛津LC-2010高效液相色谱仪，CLASSVP色谱处理系统(配有四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱、紫外检测器)。薄层层析用硅胶G板(规格100 mm100 mm)，青岛海洋化工厂分厂产品。甲醇(色谱醇，Merck公司);水为重蒸水;试药均为分析纯。1.2 对照品与对照药材桂皮醛，批号：07089704;芍药苷，批号：110736-200630(供含量测定);甘草对照药材，批号120904200511、干姜对照药材;批号：9429201。均购自中国药品生物制品检定所。1.3 样品来源样品(批号20080101，20080301，20080401，20080901，20081001，20081002，20081101，20090101，20080301)及阴性对照由贵州太和制药有限公司提供。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱为 依利特C18(4.6 mm200 mm)柱号：1920162 ;流动相为甲醇-水(1981)，流速： 1.0 mlmin-1，检测波长为230 nm;柱温30 ;理论板数按芍药苷峰计算应不低于1 000。2.2 薄层鉴别2.2.1 桂枝的薄层鉴别(检桂皮醛) 取本品内容物5 g，加醋酸乙酯20 ml，浸渍15 min，滤过，滤液挥至0.5 ml，作为供试品溶液。另取桂皮醛对照品，加醋酸乙酯制成毫升含1l的溶液，作为对照品溶液。取缺桂枝的阴性对照5 g，同供试品液方法制成阴性对照液。照薄层色谱法(一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液、阴性对照液各10 l、对照品溶液12l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(6090)醋酸乙酯(173)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。1，2，3.不同批号的供试品 4. 桂皮醛对照品 5.阴性对照图1 桂皮的薄层色谱图(检桂皮醛)2.2.2 白芍的薄层鉴别(检芍药苷)取本品内容物2 g，加乙醇10 ml，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加无水乙醇制成每毫升含1mg的溶液，作为对照品溶液。取缺白芍的阴性对照2 g，同供试品液方法制成阴性对照液。照薄层色谱法(一部附录VIB)试验，吸取上述3种溶液各25l、分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷醋酸乙酯甲醇浓氨试液(8140.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液。在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图2。1，2，3.不同批号的供试品 4. 芍药苷对照品 5.阴性对照图2 白芍的薄层色谱图(检芍药苷)2.2.3 甘草的鉴别取本品内容物2 g，加甲醇20 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，10ml/次，弃去乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，15ml/次，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水10ml洗涤后浓缩至干，残渣加水2ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5 g同法制成对照药材溶液。取缺甘草的阴性对照2g，同供试品液方法制成阴性对照液。照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述对照药材溶液2 l，供试品溶液及阴性对照液各510 l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸冰醋酸水(15112)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上显相同的黄色斑点;置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点，见图3。2.2.4 生姜的鉴别取本品内容物4 g，加醋酸乙酯20 ml，不时振摇，浸渍15 min，滤过，滤液挥至2 ml，作为供试品溶液。另取干姜对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取缺甘草的阴性对照4 g，同供试品液方法制成阴性对照液。照薄层色谱法(部附录VI B)试验，吸取上述3种溶液各510 l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯(91)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛硫酸溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图4。A-自然光下 B-紫外光灯(365nm)下1，2，3.不同批号的供试品 4. 甘草对照药材 5.阴性对照图3 甘草的薄层色谱图1，2，3.不同批号的供试品 4.干姜对照药材 5.阴性对照图4 生姜的薄层色谱图2.3 含量测定2.3.1 对照品贮备液的制备精密称取经80干燥至恒重的芍药苷对照品，加甲醇制成每毫升含0.2 mg的对照溶液，即得。2.3.2 供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，混匀，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 ml，精密称定，超声处理30 min，冷却，用甲醇补足减失的重量，上清液用微孔滤膜(0.45m)滤过，取续滤液，即得。2.3.3 阴性对照溶液的制备取处方中除白芍外的其他药材，按处方剂量及制法和工艺要求制备缺白芍的空白样品，照含量测定项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照样品溶液。2.3.4 样品测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 l，注入液相色谱仪，以外标法计算测定，即得。2.3.5 系统适用性试验及专属性考察分别吸取对照品溶液、样品溶液及阴性对照液各10 l注入色谱仪，记录色谱图，从色谱图可见，阴性对照液在与对照品白芍苷相同的保留时间位置，无其他干扰峰出现，表明除白芍外的其他药材和辅料对白芍苷峰无干扰。结果见图5。A-芍药苷 B-供试品 C-阴性样品图5 HPLC图2.3.6 线性关系考察分别精密吸取浓度为0.428 4 mg/ml的芍药苷对照品溶液1、2、3、4、5 ml，分别置10 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得浓度分别为0.043，0.086，0.129，0.172，0.215 mg/ml的溶液，各进样10l，测定，记录峰面积值，以峰面积Y为纵坐标，进样量X(g)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=1.34106X-5.08103 r=0.999 965，其在0.432.15 g浓度范围内线性关系良好。2.3.7 精密度实验精密吸取对照品溶液，重复进样5次，10 l/次，以芍药苷峰面积计，RSD为1.1%。2.3.8 重复性实验取批号为20080101样品的6份，按含量测定项下的方法进行供试品溶液的制备和测定，考察测定方法的重现性，RSD为0.76%。2.3.9 稳定性实验取同一供试品溶液，20室温放置，分别于0，2，3，4，5，7，8，9 h进样，每次10l，记录色谱图，以峰面积进行计算，RSD为0.49%。2.3.10 回收率试验称取20080101批样品粉末(含量为：46.16 mg/g)0.1g，共取6份，精密加入甲醇50 ml，分别精密加入对照品溶液(37.17 mg/25ml，甲醇配制成1.48 mg/ml)3 ml，溶剂总量为53 ml，照供试品溶液制备方法操作，按含量测定项下的操作和测定法进行测定，计算对照品的回收率。结果见表1。2.3.11 样品测定分别取9个批号的小建中胶囊样品按样品溶液的制备方法制备;分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 l，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量。结果见表2。表1 回收率实验结果表2 样品含量测定结果mg3 讨论3.1 桂皮的鉴别2原标准为取内容物5 g，研细，加水50 ml使溶解，滤过 ，用乙醚振摇提取3次，20ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加醋酸乙酯0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。在实验中，用水溶解后很难滤过，提取过程也较繁琐，提取的样品液与本实验方法提取的样品一起展开，所得斑点结果一致，但本实验方法简单，且节约试剂。3.2 白芍的鉴别2原标准方法与本实验方法一样，本实验方法只是用毒性较低的二氯甲烷替代了三氯甲烷这，二者展出的斑点结果一致。3.3 甘草的鉴别2原标准为取本品内容物2 g，加甲醇20 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，10ml/次，弃去乙醚液，水溶液用正丁醇振摇提取2次，15ml/次，合并正丁醇液，用少量水洗涤后浓缩至干，残渣加水3 ml使溶解，静置，滤过，滤液加稀盐酸1 ml，摇匀，静置30 min，离心，弃去上清液，沉淀加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。原标准在实验过程中发现用甘草酸铵对照品作鉴别对照，点于短的薄层板(10 cm长)上展开，取出，晾干，置紫外灯光(365 nm)下，通过反复实验，根本看不到对照品斑点。后改用长的薄层板(20 cm长)，展开19cm，用1%的氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，虽然对照品斑点已显现，但Rf值很低，并且与样品斑点的重现性差;用硅胶G板，对照品的斑点Rf值要高些，但重现性也不太好。另外样品提取过程中，离心后，沉淀很少，有时见不到沉淀，本实验改用甘草对照药材作鉴别对照，并且简化了提取方法，与样品点于同一硅胶G板，能得到较好的鉴别色谱，阴性无干扰。3.4 生姜的鉴别为新增项目，由于中检所不提供生姜对照药材，通过查阅相关文献资料，确认生姜和干姜的主要成分基本一致1，3，4，所以本法以干姜对照药材为对照。本实验曾试用了不同的提取溶剂与不同的提取方法，用本实验展开系统展开，结果展出的斑点一致，但方法6，即本实验方法简单，节约成本，易点样，斑点清晰。表3 提取溶剂及提取方法的选择本实验曾试用有以下的展开系统，环己烷乙醚(11)(中国药典2005年版一部干姜鉴别项下的展开系统)、环己烷乙醚醋酸乙酯(554)、石油醚(6090)醋酸乙酯(91)、环己烷醋酸乙酯(91)、甲苯醋酸乙酯甲醇(811)、甲苯醋酸乙酯(191)等，但由于本品处方中的生姜与桂枝都含有挥发油，阴性都有干扰，本法能消除桂枝对生姜的阴性干扰。3.5 流动相比例的选择通过对甲醇-水3070 (原标准方法);2575;1981三种不同比例进行实验，发现前两个比例样品峰分离不好，比例为1981的比例分离效果好，故选为本系统流动相。3.6 本实验通过与原标准4批样品含量测定的比较，4批产品测定表明，芍药苷现拟标