沉淀反应与凝集反应.ppt

免疫学及免疫学检验,沉淀反应 （precipitation reaction) 毛旭虎 医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO二年三月,免疫学及免疫学检验,可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀,免疫学及免疫学检验,1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、 微量、自动化的新阶段。,免疫学及免疫学检验,根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应,免疫学及免疫学检验,第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀,免疫学及免疫学检验,一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。,免疫学及免疫学检验,(一) 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤 1. 抗原稀释法 (1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。,免疫学及免疫学检验,2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。 3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。,免疫学及免疫学检验,(三) 方法评价 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,免疫学及免疫学检验,二、环状沉淀试验 环状沉淀(ring precipitation)试验是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。,免疫学及免疫学检验,(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳 白色沉淀环。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤 1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.52mm)底部，避免产生气泡。 2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。 3. 置沉淀管于室温下使其反应，15min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。,免疫学及免疫学检验,(三) 方法评价 该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(320mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。,免疫学及免疫学检验,三、免疫浊度试验 经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法有耗时、敏感度低(10100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法(transmission turbidimetry)、散射比浊法(nephelometry)和免疫胶乳比浊法(immunolatex turbidimetry)，借助多种自动化分析仪器来完成。,免疫学及免疫学检验,(一) 透射比浊法 1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,免疫学及免疫学检验,2. 操作步骤 (1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。 (2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。 (3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。,免疫学及免疫学检验,3. 方法评价 敏感度高于单相琼脂扩散试验510倍，批内、批间重复性较好，变异系数10%，操作简便快速，1h可报告结果。,免疫学及免疫学检验,(二) 散射比浊法 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephelome-try)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。,免疫学及免疫学检验,1. 速率散射比浊法 (1) 原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不同，通过微电脑处理，求出抗原含量。,免疫学及免疫学检验,(2) 操作步骤： 1) 用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。 2) 将稀释待检抗原和不同浓度抗原标准品加至试管内，再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位(RU)。 3) 以抗原标准品含量为横坐标，RU值为纵坐标，于普通坐标纸上绘制标准曲线。根据待测抗原RU值，查出相应抗原含量。,免疫学及免疫学检验,(3) 方法评价： 检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本；敏感度高，最小检出量达g/L水平。,免疫学及免疫学检验,2. 终点散射比浊法 (1) 原理： 让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。,免疫学及免疫学检验,(2) 操作步骤 1) 用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。 2) 取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵育一定时间，比浊。 3) 以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查出抗原含量。,免疫学及免疫学检验,(3) 方法评价： 敏感度达mg/L水平，可自动化，但反应时间较长,免疫学及免疫学检验,(三) 免疫胶乳比浊法 1. 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,免疫学及免疫学检验,2. 操作步骤 1) 用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。 2) 将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。 3) 以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。,免疫学及免疫学检验,3. 方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEC沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。,免疫学及免疫学检验,第二节 凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：双相琼脂扩散试验(double gel diffusion test)，单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test)，凝胶免疫电泳(gel immunoelec-trophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。,免疫学及免疫学检验,一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤 1. 将抗体和0.9%琼脂糖5056混合，即刻倾注成平板。 2. 待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3. 置37，让其向四周自由扩散，2448h后可见其孔周围出现沉淀环。,免疫学及免疫学检验,单向免疫扩散试验示意图,免疫学及免疫学检验,沉淀环的直径与待检标本内含量不是直线关系，有两种计算方法： (1) Mancini曲线：适用于大分子抗原，扩散时间48h，使用普通坐标纸作图，扩散环直径平方和浓度呈线性关系。 (2) Fehcy曲线：适用于分子抗原，扩散时间较短，使用半对数坐标纸作图，抗原量的对数和扩散圈直径之间呈线性关系。,免疫学及免疫学检验,双免疫扩散试验 （ double immunodiffusion） 双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。,免疫学及免疫学检验,双向免疫扩散试验示意图,免疫学及免疫学检验,第三节 免疫电泳技术 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。,免疫学及免疫学检验,免疫电泳包括: 免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳 免疫印迹等,免疫学及免疫学检验,一）、免疫电泳 免疫电泳为区带电泳与免疫双向扩散的结合。方法是先将样品加入琼脂中利用区带电泳技术将抗原各成分依电泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多条弧形沉淀线。,免疫学及免疫学检验,免疫学及免疫学检验,免疫学及免疫学检验,常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。,免疫学及免疫学检验,二）、对流免疫电泳 对流免疫电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散技术，其基本原理是：将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。,免疫学及免疫学检验,对流电泳示意图,免疫学及免疫学检验,三）、火箭免疫电泳 火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。,免疫学及免疫学检验,方法：在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距23mA/cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。,免疫学及免疫学检验,火箭电泳图 为标本；为标准抗原,免疫学及免疫学检验,四）免疫印迹法（immunoblotting） 又称为Western- blot 应用举例：用免疫印迹法检查患者血清中的HIV病毒抗体,免疫学及免疫学检验,第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离,免疫学及免疫学检验,第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上,免疫学及免疫学检验,第三步：将待检病人血清加入覆盖于硝酸纤维膜上,免疫学及免疫学检验,第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上,免疫学及免疫学检验,第五步：加入显色底物（或放射自显影）显现第二抗体,免疫学及免疫学检验,下次课内容: 凝集反应 时间: 2002/3 教员: 毛旭虎,免疫学及免疫学检验,免疫学及免疫学检验,凝集反应 （agglutination) 毛旭虎 医学检验系临床微生物学及免疫学教研室 二OO二年三月,免疫学及免疫学检验,细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应（agglutination）。,免疫学及免疫学检验,1896年，Widal就利用伤寒病人的血清与 伤寒杆菌发生特异性凝集的现象， 有效地诊断伤寒病。 1900年，Landsteriner在特异性血凝现象的 基础上发现了人ABO血型，并于1930年获得了诺贝尔奖。,免疫学及免疫学检验,凝集反应可分为： 直接凝集反应 间接凝集反应,免疫学及免疫学检验,一）直接凝集反应 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应（direct agglutination）。凝集反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen），抗全称为凝集素（agglutinin）。常用的凝集试验有玻片法和试管法两种。,免疫学及免疫学检验,玻片法： ABO血型的鉴定 试管法： 肥达试验（Widal test）-伤寒 外斐试验（Weil-Felix test）-立克次体,免疫学及免疫学检验,二）间接凝集反应 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条 件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应（indirectagglutination）或被动凝集反应（passiveagglutination）。,免疫学及免疫学检验,根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝 集反应的方式，间接凝集反应可分为： 正向间接凝集试验 反向间接凝集试验 正向间接凝集抑制试验 反向间接凝集抑制试验,免疫学及免疫学检验,1。正向间接凝集试验： 用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体,免疫学及免疫学检验,2反向间接凝集反应 用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原,免疫学及免疫学检验,3正向间接凝集抑制反应 抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。,免疫学及免疫学检验,间接凝集抑制反应原理示意图 A：标本中含抗原B：标本中不含抗原,免疫学及免疫学检验,4反向间接凝集抑制反应 抗体致敏的颗粒载体及相应的抗原，用于检测标本中是否存在与致敏抗体相同的抗体。,免疫学及免疫学检验,在间接凝集反应中，可用作载体的颗粒种类 很多，常用的有动物或人红细胞、细菌和多 种惰性