超声波辅助提取金银花总黄酮的工艺研究

太原工业学院毕业论文1 前言1.1 金银花的概况 金银花历史悠久，早在本草纲目中就有记载。金银花的花朵刚开始为白色花，一段时间以后转变为黄色花。金银花具有消炎解毒，降血压等功效，用于热性病且效果显著。所以植物金银花也被誉为疗效显著的中草药1。1.1.1 金银花的生长习性及产地分布金银花适应性很强，对土壤的要求不高，肥沃土壤为最佳，光照充足即可。生活力极强，可生长在海拔1500米处。金银花由于适应力强对土壤和气候要求不是很严，所以生长分布比较广泛，全国均有生长。种植区域主要在鲁，陕等地。其中，山东产区，品种多面积广。1.1.2 金银花的药理作用抗炎解热作用：在炎症早期，会发生毛细血管通透性增加的现象。这种现象的表现形式是发生了渗出性水肿。出现这种状况时释放更多的肾上腺皮质激素可以对这种现象有所缓解。金银花可以做到这一点。加强免疫机能作用：由于白细胞增多可引起免疫力的下降，若想提高免疫力，则需使白细胞的吞噬能力增强2，然而金银花注射液对白细胞吞噬能力有促进作用。中枢兴奋作用：绿原酸具有可引起中枢神经系统兴奋的作用，金银花中的活性成分包含绿原酸，即金银花具有使中枢兴奋的能力。降血脂作用：在血浆中，由于胆固醇的含量减少，出现血脂降低的现象。这是由于肠内的胆固醇吸收量减少的缘故。金银花具有此功能。抗病毒作用：金银花提取物可作用于病毒，降低病毒感染几率3。1.1.3 金银花的药用价值金银花有很高的药用价值，其功效主要以清热解毒为主，主治温病发热等症状4。研究证明，金银花中含有的药理活性成分主要为绿原酸、木犀草素等。多种致病菌种和致病病毒因为这些有效的活性成分而被抑制，另外对于护肝、止血、抗肿瘤、解热、消炎、增强免疫力均起作用。金银花的临床用途也很广泛，可与其他药物配合用于治疗四十多种病症，包括高血压、急性泌尿系统感染、呼吸道感染等症状。金银花茶还具有独特的减肥功能，同时还可以抑制和杀灭咽喉部的病菌，经常服用金银花茶有利于咽喉肿痛、风火目赤、肝热症、肝热性高血压和肥胖症的治疗与康复。1.1.4 金银花的经济价值金银花的花蕾中含有绿原酸、黄酮类化合物，皂甙、肌醇和单宁等有效的药用成分，这些有效的药用成分使金银花具有广谱抗菌和清热解毒的作用，在临床上主要用于治疗咽喉炎、扁桃体炎以及肺炎等呼吸系统疾病和疮疡、痢疾等症状5。同样的，金银花的花蕾及茎叶中含有多种营养物质，其氨基酸含量在8%左右且种类多，碳水化合物在18%以上还含有铁、锌、锰、铬、铜、镍、钴、硅等人体必需微量元素，这些营养物质具有较高的营养价值和保健作用，目前已经被广泛的应用于生产各种保健品中，如金银花茶、金银花牙膏等。由于金银花的广泛的药用价值和保健功能，以金银花为主要原料的药品和保健品品种繁多，效果良好，给商家带来了无限商机。1.2 总黄酮的概况 在诸多种类的中草药中，能够起到相同功效的中草药往往是由于他们所含有相同的有效成分。黄酮类物质就属于这种有效成分中的一种，由于在很多植物中都能够提取到，所以属于天然产物。生物中黄酮类化合物也称为总黄酮。 1.2.1 黄酮类化合物的分类自然界中其主要结构是以和糖分子结合形成苷的方式，还有以游离单体的方式。其中结构为苷类的，由于结构中引入糖分子，所以具有旋光性，且多为左旋。黄酮类化合物的结构是由三碳键将A苯环和B苯环两个苯环相互连接构成的，其基本骨架可表示为C6-C3-C66。它主要指基本母核为2-苯基色原酮的化合物，因其具有良好的水溶性，又具有酚羟基团，故显一定酸性，易溶于碱液中。自然界中黄酮化合物主核上经常会发生一些官能团被具有显色性的官能团所替换，如（CH3)2CHCH=CHO-、-CH2-OH、CH3O-、-OH等7，使得其往往具有许多不同的生物化学作用，且其呈现浅黄色粉末。依据不同的标准可以将黄酮化合物分为不同的类别，其中通过判断连接A苯环与B苯环之间的三碳链氧化程度、B苯环的结合位点在2-位或3-位和三碳链的结构是否发生环化的区别，把黄酮类化合物大致划分为黄酮和黄酮醇（flavonol）、黄烷醇、异黄酮（isoflavone）、双氢黄酮、双氢黄酮醇、橙酮、黄烷酮和黄烷酮醇、花色素（anthocyanidin）、查耳酮（chalcone)、黄烷二醇（3,4）10大类8。黄酮化合物是自然界植物中的广泛存在的有机化合物，每种植物中的含量多少不一，且在不同植物中具有不同的理化性质。槲皮素作为黄酮的一类，最近受到广大学者的研究，发现其是黄酮的主要组成部分，在生理、药物方面起关键作用。1.2.2 黄酮类化合物的分布黄酮类化合物广泛的存在于植物中，尤其主要存在与维管束植物中，而在其中大多数集中在如豆科、蔷薇科的被子植物当中9。由于种类不同所以存在的植物品种也不相同。如，金银花中的木犀草素与芜菜中的芹菜素属于黄酮类；银杏叶中的山奈素和槲皮素是黄酮醇类；二氢黄酮类存在于甘草和橙皮中；桑枝中的二氢桑色素、满山红中的二氢槲皮素均属于二氢黄酮醇类10。又由于分子结构的不同所以作用的器官也不同，如维护心血管系统时可多食山楂或多饮银杏叶茶。平时则可以多食或多饮一些含有黄酮的食物，以保健身体。1.2.3 黄酮类化合物的理化特性黄酮类化合物的水溶性较好，由结构式可以看出其具有酚羟基的官能团，故具有一定的酸性。在碱性溶液中溶解度较好。1.2.4 黄酮类化合物的生理活性 黄酮类化合物是植物在光照条件下生成的一大类次级有机产物，具有多种生理作用11。黄酮化合物含量的丰富，保证其可以被大量应用在食品的生产和疾病的治疗中，其制成的保健品更是成为人们生活中不可或缺的东西。对人的身体具有众多的生物活性作用，如消炎、降低异常毛细血管壁的通透性和减少阻力、抗肝炎、改变体内酶活性、调节血压、抑制菌的扩散、抗肿瘤等。近年来关于黄酮类化合物具有保护DNA效果的研究，使人类找到预防并治愈癌症、脑功能障碍、白内障等疾病的办法，进一步推动了抗癌药物的研制。实验研究发现黄酮类化合物所具有的抗氧化生物特性，对人体中O2-和DPPH自由基具有较强的抑制效果，增强人体的抵抗力，近年来已逐渐成为科学关注的热点问题12。黄酮化合物不仅具有抗细胞衰老和增强人体免疫功能等生理活性作用，同时还可以作为食物的保鲜剂和动物的饲料。作为一种大量分布于蔬菜、水果中的有机化合物，其众多的生理活性引起人们的关注，已被广泛应用于生产、生活中的各个领域。1.3超声波 用超声波提取黄酮类化合物，是最近比较新颖的方法。超声波是指频率在20千赫至50兆赫之间的电磁波13，是人听觉以外的一种机械声波。做为一种新的提取方法，其与传统的溶剂提取相比较有着提取率高、操作简单等优势，渐渐成为有机化合物提取的主要方法。近年来，随着科学制造技术的不断推进，超声波仪器的生产也日益精确、高效。大量学者对超声波提取技术的不断研究和认识，使超声波提取技术得到更加广泛的应用，如：在医药、生物食品的的生产中，以及众多生物类有机化合物的提取、分离研究当中。1.3.1超声波提取技术原理超声波提取是一种通过超声波在乙醇溶液中传播的过程中，乙醇所产生的空化效应，在空穴破裂的瞬间金银花细胞造成损坏，使细胞中的黄酮类化合物溶出。超声波提取技术是根据机械效应、空化效应和热效应而作用的14。 （1）机械效应 超声波在乙醇溶液中传播时溶液所产生的不断振荡，可以加速乙醇溶液的扩散蔓延和浸润，使金银花中黄酮化合物得到充分的提取。 （2）空化效应 作为超声波提取的主要能量来源，空穴的形成是由于乙醇分子间距大于乙醇持续具有溶解作用的临界分子间的距离。在超声波的连续作用下，空穴会发生瞬间的破裂，在此期间会产生巨大的能量，对金银花叶细胞形成强烈的冲击作用，从而造成细胞结构的破坏和内溶物的流出，这可以大大提高黄酮化合物的释放。 （3）热效应 超声波在乙醇提取剂里传播的过程中，其不断的振动导致乙醇溶液的温度升高，从而导致金银花提取物温度的升高，加快了含黄酮的有效成分的溶出速度。此方法金银花细胞内温度的变化在很短的时间内完成，极大减少黄酮类成分生物活性的改变，使黄酮化合物保持原有的结构和活性，有利于提高黄酮的提取率。1.3.2 超声波提取技术的特点（1）超声波提取效率高，能够提高原材料的利用率，从而提高经济效益。（2）超声波提取不需要单独加热，减少了需要长时间加热对黄酮类化合物活性造成的不良影响。同时因为不需要加热，因此可以大量节约能源和改善环境污染，适用于热不稳定、易水解或易氧化化合物的提取。（3）超声波提取时间较短，一般在30-50分钟就可以获得很高的提取率（4）超声波提取与其他提取技术相比较节约能源，能减少提取溶剂的使用量，从而降低了使用溶剂对环境污染的危害。（5）超声波技术的合理使用，保证了有效成分与产品质量的稳定性，使产品品质提高。（6）超声波技术的适应性广，不受中药材的极性、分子量的限制15。1.4国内外研究现状1.4.1 国内研究现状金银花因其药理作用和药用价值因而具有很高的经济价值16。黄酮类化合物的生理活性使其具备了广泛的临床应用。所以从金银花中提取总黄酮成为研究热点。研究表明，金银花具有消炎解毒、降压降血脂等作用，是疗效显著的良药。超声波提取技术是一种新型的提取技术，因其环保高效、简单易行等特点，多用于提取中草药的有效成分中。近几年来，随着黄酮化合物利用价值被不断开发出来，对于黄酮的纯度具有更高的要求，国外一些学者通过大孔吸附的方法对粗黄酮进行萃取、纯化。此技术良好的效果，引起国内学者的高度关注，将其大量应用在一些黄酮化合物的分离纯化过程中。例如，张妍就通过运用大孔吸附树脂柱顺利地从山楂中分离出黄酮类化合物，并进行纯化、分析。张睿、徐雅琴17通过实验分别比较了九种提取方法对于提取黄酮类化合物的影响，并阐述了这九种方法的优缺点。1.4.2 国外研究现状最近各国生物化学研究者都在努力利用各种先进提取技术，试图提取分离出具有更高活性、纯度的天然类黄酮化合物从自然界的植物当中，推动治癌药物的研制，生产具有调节人体免疫系统和分泌系统的保健食品和药品等。黄酮类化合物作为一种可以预防、治愈心脑血管疾病的物质，引起众多国内外学者的研究热潮。他们通过对酶活性、催化强度等的调节，分离出所需要的具有特定生理活性作用的天然物质。Orawan Khantamat18等通过对黄酮生化功能进行分析，发现其对人口腔表皮癌细胞的蔓延、恶化具有一定的遏制作用。KimSy19从桑树叶中分离出九类具有抗氧化性的黄酮化合物，并通过光谱和化学研究发现槲皮素-3-O-D-吡喃葡萄糖基-(16)-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素在1，1-二苯基-2-苦基肼自由基表现出明显的自由基清除效果。Lei Zhang 20等研究黄酮化合物的提取条件，通过与溶剂回流提取法相比较，发现超声波提取法的工艺条件更加简单且提取率较高。利用高效液相色谱法（HPLC）进行分离、纯化，并通过电喷雾离子化质谱仪（EESI）和二极管阵列检测器（PDA）将所分离的20多种黄酮化合物进行鉴别。综上所述，超声波提取技术在提取中草药的有效成分中多有应用。超声波技术以其提取时间短、效率高、操作简单和环保等优势被认知。在提取过程当中，可减少溶剂的使用量，有效降低对环境的污染。本实验通过优选超声波辅助提取金银花中的总黄酮的最佳工艺条件。为进一步开发利用和工业化生产奠定基础。 1.5 研究内容及意义 本实验研究的主要内容是通过单一控制变量的方法对3个因素进行分别分析，比较各自对黄酮溶出率的作用效果，进而利用正交法筛选出最优的提取工艺。 随着黄酮类化合物的药理、生理作用被逐渐地认识和开发，以及提取方法、萃取纯化技术和含量测定分析技术的日益成熟，黄酮类化合物被从众多植物中分离出来，已成为食品、药品生产领域的主要物质。金银花作为含有黄酮化合物的植物，具有很高的保健、药用价值，近年来受到国内外学者的大量关注，其提取方法、工艺条件也日益完善。而超声波提取技术作为一种新型的提取技术，由于其提取率高、对提取物的损害少、操作简单等特点已被广泛应用于药物制剂的检查和植物中有机化合物的提取等领域中，具有广泛的应用前景。本实验通过对工艺的优化，提高金银花中黄酮的溶出率，实现资源最大化。2 实验部分2.1 实验仪器与试剂2.1.1 实验仪器 主要仪器见表2.1表2.1 实验主要仪器仪器名称型号生产厂家电子分析天平电热恒温水浴锅微型植物试样粉碎机紫外可见分光光度计超声波清洗机高速离心机AY220HHS-2FZ102752NBL22-600LD5-2A日本岛津公司科学上海天平仪器厂北京中兴伟业仪器有限公司上海精密仪器公司上海比朗仪器有限公司北京医用离心机厂 2.1.2实验材料与试剂实验材料与试剂见表2.2表2.2 实验材料与试剂材料与试剂名称型号生产厂家金银花茶芦丁硝酸铝氢氧化钠亚硝酸钠无水乙醇干燥花茶分析纯分析纯分析纯分析纯芜湖市东方茶叶有限公司天津市东丽区天大化学试剂厂天津市大陆化学制剂厂天津申泰化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司2.2 总黄酮含量的定量分析2.2.1 金银花的预处理将干燥的金银花用微型植物粉碎机粉碎，放于干燥处备用。2.2.2 标准溶液的配制 （1）制备芦丁标准溶液：精确称量0.0200克的芦丁标准试剂放入烧杯中，加入30%的乙醇溶液，60水浴加热，使其完全溶解，然后转移到以100毫升的容量瓶中，再加入30%的乙醇溶液至100毫升处，摇匀，即配置成芦丁标准溶液。 （2）制备金银花提取液：精密称取0.5000克干燥的金银花粉末，加入30毫升去离子水在100恒温水浴锅中提取一段时间后，过滤出滤液，滤渣继续用30毫升去离子水在恒温水浴锅中浸提一段时间，过滤，合并滤液，并定容于100mL容量瓶中，振荡均匀，待用。(3)测定最大吸收波长的选择方法：分别向各样品提取液以及芦丁标准液中加入适量的亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液，10min后用752N型紫外可见分光光度计于400-600nm范围内进行测定，确定吸收波峰处的波长max。2.2.3 标准曲线的绘制精密吸取芦丁标准溶液0，1，2，3，4，5mL21，分别置25ml容量瓶中，首先分别向容量瓶中加入30%的乙醇溶液大约至12.5mL，之后分别滴加一定量的亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠溶液，用30%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置10min。采用分光光度法，在最大吸收波长处测定吸光度，与空白试剂作为参考，芦丁标准溶液浓度与吸光度分别为横坐标和纵坐标，绘制芦丁浓度与吸光度之间的标准曲线。2.3 单因素实验准确称量0.5000g金银花粉末，在超声波清洗机中浸提一定时间后，测定其吸光度，从而计算出金银花中黄酮的含量。实验中通过对超声时间、料液比、超声功率等因素的分析得出不同因素对总黄酮提取的影响。（超声温度为40摄氏度，乙醇浓度为30%）2.3.1 超声时间对总黄酮提取率的影响精确称取金银花粉末5份各0.5000克，在料液比1：20（g/ml），超声功率为400W的提取条件下，进行超声提取10、20、30、40和50分钟后，于max处测定相应的吸光度，并计算出提取率。2.3.2 料液比对总黄酮提取率的影响精确称取5份各0.5000克的金银花粉末，在提取条件为400W的提取功率和30分钟的提取时间的情况下，料液比按照1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/ml）分别m处测定吸光度，并计算出相应的提取率。2.3.3 超声功率对总黄酮提取率的影响精确称取金银花粉末5份各0.5000克，选取100W、200W、300W、400W、500W的超声功率进行操作。料液比为1：20（g/mL）的条件下进行超声30分钟。分别在m处测定吸光度，并计算出提取率。2.3.4 正交试验确定提取黄酮的最佳工艺 根据单因素实验，分别选择超声时间（A）、料液比（B）和超声功率（C）作为考察因素，设计正交表，计算得出最佳超声条件。2.4 传统方法测定黄酮提取率精密吸取0.50mL金银花提取液置于25mL容量瓶中，首先分别向容量瓶中加入30%的乙醇溶液大约至12.5mL，之后分别加入一定量的亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠溶液，用30%的乙醇溶液定容至刻度，混合均匀，静置一段时间。10min后以相应试剂作空白，于最大吸收波长max处测定吸光度，从标准曲线上读出样品中总黄酮的浓度并计算。2.5 最佳实验条件的验证 为了进一步验证正交试验所筛选的提取工艺条件为最佳参数，准确称取8份0.5000克的金银花粉末,以质量分数为30的乙醇溶液作为溶剂，在最优提取工艺条件下于最大吸收波长max处测定吸光值，从而计算金银花粉末中所含黄酮的量。求取8组的平均黄酮提取率，并通过与单因素试验和正交试验的结果进行比较，判断正交试验所筛选的最优提取条件是否可行。3 结果与讨论3.1芦丁标准曲线的绘制3.1.1测定最大波长精密吸取芦丁标准溶液和金银花提取液适量,按标准曲线操作条件下操作显色，10分钟后用752N型紫外可见分光光度计于400-600nm范围内进行扫描,结果显示在510nm处均有最大吸收峰max(见表3.1、图3.1和表3.2、图3.2)。波长 (nm)400420440460480500吸光度 A0.6680.6570.5280.5430.6190.678表3.1 芦丁的最大吸收波长波长 (nm)510520540560580600吸光度 A0.6870.6620.5710.4140.2860.146图3.1 芦丁标准溶液的最大吸收波长图表3.2 金银花提取液的最大吸收波长波长 (nm)400420440460480500 吸光度 A0.2630.2510.2380.2520.2910.323波长 (nm)510520540560580600吸光度 A0.3350.3320.3020.2450.1680.111图3.2 金银花提取液的最大吸收波长图3.1.2 芦丁标准曲线的绘制表3.3 标准曲线表编号12345芦丁浓度（mg/mL）0.00810.01620.02430.03240.0405吸光度A0.1020.2380.3050.4390.556图3.3 标准曲线图以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为：Y=13.691X-0.0047，R2=0.9918，表明在一定范围内线形关系良好。3.2金银花中总黄酮提取率的计算 在最大波长510nm处测定吸光度，从标准曲线上读出样品中总黄酮的浓度，并按下式计算含量：3.3 单因素实验结果3.3.1 提取时间对总黄酮提取率的影响 根据表3.4提取时间影响的实验结果与图3.4提取时间与提取率可知，时间为30min时提取率最高，按照数据，选取20min、30min、40min三个水平做正交实验设计。表3.4 提取时间影响的实验结果时间(min)金银花质量（g）吸光度A总黄酮含量100.50310.21816.22%200.51120.25318.41%300.50850.26719.52%400.50230.23517.46%500.51020.21315.63% 图3.4 提取时间与提取率 由图3.4可以看出，以浓度为30的乙醇溶液作溶剂时，在料液比、超声功率一定的情况下，随着提取时间从10min到30min的不断延长，总黄酮的提取量也越来越大，在30-50min之间，由于金银花中黄酮含量的不断减少，使其提取率呈现一种下降的趋势。综上，将20min初步定为最佳的提取时间。3.3.2 料液比对总黄酮提取率的影响 根据表3.5料液比影响的实验结果与图3.5料液比与提取率可知，料液比为1:20时总黄酮的提取率最高为20.25%，观察数据，选取料液比为1:10、1:20、1:30进行正交实验设计，并选出最优料液比。 表3.5 料液比影响的实验结果料液比（mg/ml）金银花质量（g）吸光度A总黄酮提取率1:100.51240.23717.31%1:200.50190.27320.01%1:300.51710.25218.12%1:400.50890.23216.93%1:500.51420.22516.35%图3.5 料液比与提取率 由图3.5可以看出，在超声功率和时间的确定情况下，以质量分数为30的乙醇溶液作溶剂时，料液比为1:10-1:20（g/ml）时黄酮提取率随料液比增加而逐渐增加，在料液比为1:20-1:50（g/ml）时，呈下降趋势，故料液比在1:20g/ml时提取率最高。这一现象可能是由于乙醇体积的逐渐增加，使得黄酮在提取液中的相对浓度降低，由提取液中黄酮浓度与提取液边界层的浓度差形成的扩散作用力也相对增加，有利于黄酮化合物的释放，因而提取液中黄酮含量较高；相反乙醇溶剂体积较少时，提取液中相对的黄酮浓度就会较高，浓度差造成的作用力较小，不能加速黄酮化合物的溶出，因而黄酮提取率较低。同时考虑到对资源的节约，初步确定1:20g/ml为最佳料液比。3.3.3 超声功率对总黄酮提取率的影响 根据表3.6超声功率影响的实验结果与图3.6超声功率与提取功率可以看出，在超声功率在400W时，总黄酮提取率为最大19.4%，依据数据，选取300W、400W、500W为正交实验设计数据，并通过正交实验计算选取最佳超声功率。表3.6 超声功率影响的实验结果超声功率（W）金银花质量（g）吸光度A总黄酮提取率1000.50780.20114.72%2000.51320.23917.38%3000.50510.25118.53%4000.51430.26819.42%5000.51070.24918.19%图3.6 超声功率与提取功率 由图3.6可以看出，在料液比、超声时间恒定的情况下，用浓度为30的乙醇溶液作溶剂时，在100-500W的范围内，100-400W随着超声功率的越来越大，总黄酮的提取率也不断增加，而在500W处有所下降，且在400W处为最大值。表明超声波破碎提取效果的好坏主要取决于超声功率的大小，在一定范围内，随着超声功率的逐渐增加，超声波机械振动强度逐渐加强，对金银花细胞的破坏力越来越大，因而金银花叶中总黄酮的释放率越高，若超过这一范围，由于超声功率过大导致细胞的分子结果破坏，影响提取结果。因此，初步确定最佳超声功率为400W。3.4 正交实验表3.7 正交实验设计实验次数超声时间（min）料液比（mg/ml）超声功率（W）吸光度A提取率（%）123456789K1K2K3k1k2k3R11122233352.6953.0552.2317.5617.6817.410.2712323131252.4054.0951.5417.4718.0317.180.8512331223152.2956.3749.3117.4318.7916.442.350.2420.2630.2150.2350.2410.2510.2560.2230.23817.6119.5215.5617.2817.4518.3218.5316.4717.23因素主次最佳参数CBAA2B2C2根据上述的单因素实验，选取了超声功率300W、400W、500W的三个水平，料液比1:10g/ml、1:20g/ml、1:30g/ml三个水平以及超声时间10min、20min、30min三个水平。将超声功率、料液比和超声时间作为正交实验的三因素三水平进行计算，选取最佳条件。如表3.7正交实验设计极差分析可知，各因素影响总黄酮含量的程度大小顺序为CBA，即最大影响因素是超声功率，其次是料液比，影响最小的为提取时间。同时，根据正交试验结果分析可知最佳提取条件为A2、B2、C2，即料液比1:20，提取功率400W，提取时间30min，此时提取效果为最佳。3.5超声波提取法与传统方法比较3.5.1传统方法的提取率计算 按2.4步骤进