《定量PCR技术》PPT课件.ppt

定量PCR技术,李文亭,简单介绍,什么是PCR PCR的工作原理 PCR的基本反应步骤 PCR的用处 解链温度,定量PCR 理论部分,相对RT-PCR 定量RT-PCR 定量PCR 竞争性RT-PCR 实时定量PCR,定量PCR实验部分,实验准备： 实验器具与材料 实验器具的处理与准备 试剂的配制,定量PCR实验部分,实验操作 设计PCR反应引物 细胞的培养与收集 总RNA的提取 RNA完整性检测-Northern印迹技术 RNA纯度检测 合成cDNA的引物的选择 反转录为 cDNA PCR反应,The End,设计PCR反应引物,三条基本原则 引物设计软件 引物浓度要求,总RNA的提取,异硫氰酸胍/氯化铯超速离心法制备RNA 使用Trizol纯化RNA 热酚法 氯化锂-尿素法 利用Marligen总RNA快速纯化系统纯化总RNA 利用Ambion的Mitropoly(a)Pure试剂盒分离mRNA,RNA完整性检测,Northern印迹原理 Northern印迹技术是分析RNA的一种方法，该技术可定量分析某一特异基因转录的强度，根据其迁移的位置也可判断基因转录产物的大小。该技术常用于基因表达的调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。 Northern印迹步骤 琼脂凝胶电泳、转移、预杂交、杂交、漂洗、放射自显影,RNA纯度检测,待测核酸以水为溶剂并作适当稀释（这里稀释400 倍：5l RNA 样品+1995l蒸馏水），使用1cm 光程的石英比色杯，以水调好仪器的零点，然后测定并记录样品液在280，260nm 处的吸光度。以估算RNA 的纯度和浓度。 OD260/OD280在1.8-2.0时，认为RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染可以容忍。,合成cDNA的引物的选择,1）随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。 2）Oligo(dT)：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。 3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物。,PCR反应,相对RT-PCR的PCR扩增 竞争性RT-PCR的PCR扩增 实时定量PCR扩增操作,相对RT-PCR的PCR扩增,相对RT-PCR的实验过程有三个关键步骤： 1）选择一种定量方法：溴化乙锭染色，或者放射自显影-闪烁计数仪，或者用磷光摄像仪定量。 2）相对RT-PCR要确定其扩增的线性范围：复制的PCR产物每隔一个循环从热循环仪中取出并收集，通过用产物的量（取对数）对循环数作图，其线性范围是一条直线。,下一页,3）相对RT-PCR的内对照一般用看家基因，这样可使对样品进行处理和变换细胞类型时，内对照的表达不受影响。其次要求内对照的表达水平要与目的转录本的表达水平相似，这可以在扩增体系中添加竞争子来削弱看家基因的信号。竞争子是一些经过修饰无法延伸的引物。通过实验确定引物：竞争子的比例来模拟目的转录本的量，一旦这一比例被确定，他就可以和线性范围的循环参数一起对RNA样品中的转录本的量进行定量。,下一页,样品和内对照同时进行单链cDNA合成反应，之后加入到反应管中同时进行PCR的扩增，然后用变形凝胶来分析实验结果。定量样品PCR产物的相对含量，可以用基因特异性产物的信号除以内对照的信号，从而可以得到每个样品中基因特异产物的准确相对值。这些值可以用来比较样品间模板RNA的相对表达量。,返回,竞争性RT-PCR的PCR扩增,竞争性RT-PCR的关键步骤是人工竞争子的合成和纯化。竞争子与目的的内源转录本几乎一样，只是为了辨别在设计时删除了一小部分。竞争子是设计用于反转录和PCR扩增的RNA分子，与目的内源转录本具有相同的效率。 接下来是竞争子RNA的合成、纯化和定量。之后是对样品进行拷贝数的评估。要先进行预实验。即模板与梯度稀释（102）的竞争性RNA转录本同时进行PCR扩增反应。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学，可以与目的基因共同扩增，而且在每个反应中样品和竞争子PCR产物的量可以直接比较。竞争子获得的PCR产物的强度与来自于内源RNA转录本的扩增相抑制，同等强度代表RNA样品中存在的内源信息。,下一页,之后，将选择出的拷贝数2倍梯度稀释重复上述过程，以便在数据上得到更高的分辨率。 为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要做一个最终的RT-PCR实验，在这个实验中样品RNA和竞争子RNA在同一个管中被反转录。使用竞争子RNA的量要接近于在初始RT-PCR实验中所提出的量，之后进行反转录、扩增。如前所述，与内源信息产生同样信号强度的竞争子RNA的量代表了样品中内源信息的量。,返回,实时定量PCR扩增操作,A：流程： 1 标准曲线 2 待测 cDNA 的 PCR 扩增 B：软件使用 1 打开电脑 2 开启 5700，9600 的电源 3 打开 SDS 软件， 4 选择样品（反应）类型和取名,下一页,5 设置引物/探针 6 给标准样品设值 7 编辑热学过程 8 保存文档（Plate Setup） 9 点击“Run”,real time PCR 整套设备开始自动 运行。 10 查看结果，简单分析 C：数据处理 1 根据标准曲线得到待测 cDNA 中各种基因（模板）的原始数量 2 用 Ct 比较法来测算转录水平差异。,返回,异硫氰酸胍/氯化铯超速离心法制备RNA,原理： 异硫氰酸胍是一类有效解偶剂，当细胞被它溶解后，蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸解离。在4mol/L异硫氰酸胍和-巯基乙醇存在下，RNA酶失活，可提取完整的总RNA.,使用Trizol纯化RNA,原理： Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA。,热酚法,原理： 交替使用酚、氯仿两种不同的蛋白变性剂以增大去除蛋白质的效果。酚虽然为有效的蛋白质变性剂，但不能完全抑制RNase活性，而且酚能溶解10-15%的水，从而溶解部分poly(A) RNA。为此，混合使用酚和氯仿，对于RNA提取更加重要。,三条基本原则,引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,引物浓度要求,一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算： OD260 X mol/L A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度 A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。,定量PCR的原理,定量PCR是指以一种标准作对照，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量进行定量的技术。定量PCR旨在评估样本中靶基因的分子数。用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后，PCR产物的量来推断样品中原始模板的量。这种定量可以是绝对的，也可以是相对的。,RT- PCR 原理,与聚合酶链反应偶联的反转录（RT-PCR）可以扩增细胞内RNA用于分析基因表达。该程序是以RNA转录本为模板，使用逆转录病毒的逆转录酶扩增其互补的DNA(cDNA)，然后通过热稳定的DNA聚合酶扩增cDNA 。利用这种方法，使用少量的起始模板（如少至10-100个拷贝的RNA转录本），就可以检测到基因的表达。,相对RT-PCR原理,为了对RT-PCR进行定量，在相对RT-PCR中目的转录本产物的量要与内对照相比较。相对RT-PCR的结果被表示成是对照品的几倍或百分之几，因此是半定量结果。为了使相对定量RT-PCR有意义，必须在指数扩增阶段对PCR产物进行测量。为了使样品间的相对变化规范化，使用了内标（如-肌动蛋白、三磷酸甘油醛脱氢酶即GADPH、18SrRNA）。,竞争性RT-PCR 原理,竞争RT-PCR的结果以转录本的拷贝数或量来表示，因此是绝对量。竞争性RT-PCR要求使用人工合成的转录本或竞争子作为外源对照。设计竞争子时要与内源转录本具有同样的反应动力学，并且逐渐增加量的滴加进重复的RNA样品中从而产生标准的动力学曲线。应用这种方法，来自样品和竞争子的PCR产物量可以直接对比。,实时定量PCR,实时检测法在PCR反应体系中加入荧光基团，利用其就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。根据PCR 变化曲线计算出未标靶基因分子数。为了实现单管内进行实时检测的目的，就必须使探针上标记物（指示物）在杂交或游离状态存在发光强度差异，从而达到实时定量检测的目的。,PCR的工作原理,PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。,PCR的基本反应步骤,1）变性，将反应系统加热至95，使模板 DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2）退火，将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5）使引物与模板DNA退火结合； 3）延伸，将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经过多次循环（25-30次）即可