细胞增殖分化与信号转导.ppt

细胞增殖、分化、凋亡 及相关的信号转导,细胞增殖是细胞最基本的生理活动。生长因子、激素及癌基因产物等均可诱导细胞的增殖或抑制细胞的增殖，归根到底是影响细胞周期的运行。 细胞周期失控的超常运行，将导致肿瘤；停滞不前则常是细胞衰老、凋亡的前奏。,Section 1 细胞增殖与调控,G1期（first gap phase）：限制点（restriction point, R点）；继 续增殖，进入G0期，停止增殖。 S期（synthetic phase）: DNA复制，与组蛋白包装成染色质，合 成PCNA（proliferating cell nuclear antigen） G2期（second gap phase）：染色质螺旋化，合成MPF。 M期（mitotic phase）：有丝分裂。,R,一、细胞周期调控 细胞周期由MPF（maturation promoting factor）推动 cdc2（cell division cycle 2 protein） cyclinB 哺乳动物细胞中已发现八种CLN：A、B、C、D（D1，D2， D3，D4）、E、F、G、H G0 G1期： D1、D2、 D3、 E表达增加 G1 S期： D、E降解，A合成增加（ cyclinA 为S期特征性的cyclin） 形成CDK1cyclinA,MPF,CDK4cyclinD：促使细胞通过G1的限制点 CDK6cyclinD CDK2cyclinE：启动DNA复制,G2 M期： CDK1cyclinA CDK1cyclinB：促使细胞开始有丝分裂 在G2晚期， CDK1cyclinB装配形成，其中CDK1被磷酸化（共三个磷酸化位点，分别为Thr161、Thr14、Tyr15），催化磷酸化的酶分别是： Thr161：CAKCDK activating kinase Thr14/Tyr15：Weel/Myt1 Thr161 磷酸化对CDK1活性是必需的，而Thr14/Tyr15的磷酸化对CDK1激酶活性有抑制作用。,二、细胞增殖调控 （一）生长因子及其受体 生长因子：能与细胞膜上特异的受体结合并调节细胞的生 长等生理过程的多肽类物质。 来源：血小板、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞。 作用方式：内分泌、旁分泌、自分泌。 作用机制： GFGFR GFGFR 构象改变 PTK/STK 启动底物蛋白质磷酸化及信号传递 诱导与增殖相关的基因表达 细胞增殖 如：EGF、PDGF、TGF、NGF、FGF等,（二）激素、环腺甘酸、多胺 1、激素：生长激素、胰岛素、甾体激素等 2、cAMP/cGMP 3、多胺：腐胺、精胺、亚精胺 （三）癌基因 原癌基因产物对细胞增殖分化有重要调节作用。 1、生长因子、生长因子受体：如c-sis编码PDGF B链；c-erb B 编码EGFR等。 2、具有PTK活性，构成增殖信息传感器：如c-src、c-yes、c- ros、c-abl等。 3、具有STK活性，如c-mos、c-raf。 4、p21ras为类G蛋白，与GTP结合介导信号转导。 5、转录因子：c-fos、c-jun、c-myc。 （四）周期基因（cdc）的调控,Section 2 细胞分化与调控 细胞分裂后逐渐产生与来源细胞在结构和功能上有着稳定差异的过程即为分化（differentiation）。 一、细胞分化的特点 1、稳定性：一旦确立，分化状态便稳定存在。 2、全能性：共同来源于受精卵，并保留全部信息。 3、选择性：基因表达呈选择性开闭，是不同分化细胞表型差异 的原因。 二、分化的机制 分化是细胞内不同基因在不同发育阶段选择性激活的结果，细胞内不同基因在时空上有序表达的结果。 1、“决定”先于分化 细胞“决定”（determination）：有些基因永久性地关闭，另一些基因顺序表达，使细胞具备有某一特定方向分化的能力。 多能干细胞（pluripotent cell）：具有多向分化潜能。,2、细胞质在细胞决定中的作用 细胞质决定子（cytoplasmic determinant） 某些特殊细胞发育途径的决定往往首先由细胞质控制。 3、核质的相互作用 细胞分化的基础是细胞核内基因组选择性地表达，而核内基因的活性又受核所在胞质环境的影响，是核质相互作用的结果。 4、细胞间相互作用 位置效应：细胞所在位置，与其他细胞间的关系。 （1）细胞间直接接触进行信息传递； （2）细胞外基质、粘附分子、细胞因子的作用。,三、干细胞与分化 干细胞（stem cell）：是一类增殖较慢，能自我维持增殖的 细胞，具有定向分化的潜能。 专能干细胞：干细胞分裂产生的子细胞只能分化为某一类型 的细胞。 多能干细胞：子细胞可以产生两种或两种以上类型的细胞。 造血多能干细胞 造血定向干细胞 血细胞 造血干细胞库,四、细胞分化的调控 （一）基因水平调控 house keeping genes luxury genes （二）转录水平 （三）翻译水平：选择性翻译及翻译后的不同加工。 （四）细胞外因素：包括激素、细胞因子及营养因素等。,Section 3 细胞生长障碍 表现为生长不全或过度增殖。 一、细胞增生的类型 1、生理性增生 2、病理性增生：炎性、激素失衡性和肿瘤性/恶性。 二、肿瘤细胞生长失控的机制 1、癌基因与细胞增殖 Onco编码生长因子、生长因子受体、蛋白酶、转录因子等，在调节增殖分化中具有重要作用。 2、抑癌基因与增殖：如Rb、p53,（1）Rb 磷酸化 RB pRB CDK2/cyclinE, CDK4/cyclinD, CDK6/cyclinD RBE2F不能释放E2F，使细胞处于G1期。 正常情况下，由M到G1时，pRB转变为RB；RB突变或与EIA、E7、SV40大T抗原结合时，RB失活，造成细胞周期失控及细胞恶性增殖。,（2）p53 磷酸化p53使细胞处于G1期，必要时诱导细胞凋亡。 p21 CDK RB不被磷酸化 G1 DNA损伤 p53 并磷酸化 Bax , Bcl apoptosis Gadd45 DNA修复 三、细胞周期抑制药物 1、周期非特异性药物：如氮芥 2、周期特异性药物：（1）周期特异性药物，如环磷酰胺； （2）时相特异性药物，如S期的羟基脲、阿糖胞嘧啶；M期的长 春新碱等。,Section 4 细胞分化障碍 一、分化障碍是肿瘤细胞的基本特征 分化是正常细胞、良性肿瘤细胞与恶性肿瘤细胞间的基本区别。 二、肿瘤细胞分化不全的机制 1、干细胞发育分化受阻 2、细胞癌基因的激活 3、抑癌基因的却失或失活,Section 5 肿瘤细胞的诱导分化 一、诱导分化的概念和分化诱导剂 诱导分化：在诱导分化剂的作用下，肿瘤细胞的形态、生物 学特性、生化标志等与正常细胞接近或相同，即 由恶性表型转为正常表型，又称逆转。 分化诱导剂：能使肿瘤细胞分化，出现类似正常细胞表型及 功能的物质。 1、外源性：机体自身不能合成，为非生理性。 （1）极性化合物，如DMSO； （2）佛波酯类，如TPA； （3）抗生素类，如放线菌素D、阿霉素（高浓度时为毒性作用）； （4）抗癌药物类，如5-Fu等。,2、内源性：机体自身可以产生，为生理性。 （1）维生素类，如Vitamin A、Vitamin D； （2）激素类，如甾体激素、T3等 （3）细胞因子，IFN、TGF、EPO、GMCSF、TPO等； （4）cAMP，激活PKA。 临床上，目前最为有效的诱导分化疗法是RA治疗粒系白血病。,癌基因与细胞癌变 一、癌基因的概念、分类和命名 （一）概念及发现过程 Oncogene：指能引起肿瘤的基因，即这类基因表达时能使正常 细胞转化为恶性细胞。 1911年 Rous发现了第一种逆转录病毒RSV，并证明鸡肉瘤滤液 具致瘤性，推测RSV为致瘤因子。 1970年 Martin发现一株温度敏感RSV，即tsRSV。用tsRSV感染 鸡胚成纤维细胞，35时可使之转化，但41可又使之 恢复正常。 Vogt分离到一转化缺陷突变株tsRSV，并证明所却失的 序列位于3端的一段RNA片段，命名为v-src（病毒肉瘤 基因）。这是第一个发现的病毒癌基因。,1972年 Bishop实验室（法国学者Stehelin）首先制备出32p-src 探针，并以此探针证明鸡及其他禽类细胞以及人类细胞 中均含有与v-src同源的序列，且具有真核基因的特点 （含内含子及外显子）。命名为细胞src（c-src），以后 陆续发现了其他许多种细胞癌基因。 目前，多数学者认为v-onc起源于c-onc。 原癌基因（proto-oncogene） 正常细胞中存在着c-onc样序列，与c-onc的同源性很大，差别极小，但不具转化活性；发生突变后即转为c-onc，具转化活性，因此称原癌基因。,（二）癌基因的分类 癌基因产物称癌蛋白（oncoproteins）或转化蛋白（transforming proteins）。可定位于细胞各部位，从功能上看，可以是： 生长因子类；生长因子受体类；蛋白激酶类； G蛋白类；DNA结合蛋白类（转录因子）。 （三）癌基因的命名 病毒癌基因 v-src, v-erb-A/B, N-myc, E1A, E1B等。 细胞癌基因 c-src 癌蛋白 p：p150c-abl pp60v-src p160v-gag-abl,二、原癌基因的生理功能 原癌基因实际上是与调节细胞增殖分化密切相关的基因。 （一）原癌基因与生长因子 1、sis基因与PDGF Proto-sis就是编码PDGF B链的基因，而v-sis为proto-sis不完整的变异体，v-sis（p28v-sis）为猴肉瘤病毒癌基因。 PDGF由A、B两链构成，B链N端109位aa和p28v-sis（66175aa）几乎完全相同； p28v-sis能和PDGFR结合并引起受体的酪氨酸磷酸化，表明p28v-sis和PDGF具相似的生物学活性。,2、int-2和hst/k-fgf与FGF int基因：MMTV引起肿瘤时，随机整合至鼠基因组时引起一种特异性mRNA的转录，由此克隆出的proto-onc称为int，int-2为其中的一个。 hst为人胃肿瘤（human stomach tumor）中克隆出来的转化基因，编码产物与Kaposi肉瘤DNA转染NIH/3T3细胞后克隆出的k-fgf产物相同，为同一基因。现已发现，int-2、hst基因产物和FGF同源。 （二）跨膜生长因子受体 有些癌基因产物位于膜上，为生长因子受体，具一跨膜疏水区，膜内具酪氨酸激酶（TPK）活性，如： proto-erbB和proto-neu/erbB2 EGFR； proto-fms M-CSFR； proto-kit PDGFR； proto-ros 胰岛素受体; proto-mas 血管紧张素受体等。,（三）G蛋白类 p21ras能与GTP结合，具GTPase活性。 （四）与核内DNA结合的proto-onc myc jun fos myb等。 三、原癌基因的激活与肿瘤的发生 （一）激活 1、点突变； 2、插入诱变：逆转录病毒； 3、Gene amplification：拷贝数增加； 4、染色体重排。 （二）癌基因在肿瘤发生中的作用 1、作为生长因子，以自分泌方式刺激细胞生长； 2、作为生长因子受体，仿效受体复合物，在无外源性生长因 子时也能引起细胞增殖； 3、作为生长因子，绕过受体，成为受体与核间信息传递的介 导者； 4、作为在核内对生长信号的应答者。,四、肿瘤抑制基因 肿瘤抑制基因（tumor suporessor gene）又称抑癌基因、抗癌基因（antioncogene）或隐性癌基因（recessive oncogene）等。 是指一些在细胞增殖、分化等过程中起负调节作用的野生型等位基因。丢失或灭活时有致瘤作用。 （一）肿瘤抑制基因存在的依据 1、细胞杂交实验 将正常细胞与恶性细胞融合产生的杂种细胞可出现恶性，且播种至宿主后也不再长瘤。 微细胞（microcell，仅含少数几条乃至一条染色体）融合技术进一步证实某些关键染色体可能带有肿瘤抑制基因。 有时，两种不同瘤细胞系融合后也会失去恶性表型，说明不同瘤细胞系的遗传缺陷是不同的肿瘤抑制基因的丢失或失活，融合后得到相互补充。,2、遗传型肿瘤的研究 70年代初Knudson提出的两次突变假说：遗传性肿瘤（如Rb等），第一次突变为生殖细胞突变，第二次为体细胞突变；而散发型两次均为体细胞突变。 3、肿瘤中体细胞杂合性的丢失 杂合性是指细胞中含有一对或数对不同等位基因。可用RFLP检出。 以遗传性视网膜母细胞瘤为例： 正常体细胞（杂合子）：两条带； 肿瘤细胞（纯合子）：一条带。,（三）肿瘤抑制基因产物的生化功能 1、Rb 200kb，由27个exon构成，mRNA4.7kb，位于13q14.2，编码产物由928个氨基酸残基构成（110KD），为一磷蛋白，位于核内，有两种形式。 RB能与一些DNA病毒蛋白，如SV40大T抗原、腺病毒E1A和人乳头瘤病毒的E7等结合，并使RB的负性调节作用消失，是这些DNA病毒致瘤作用的主要原因。 Rb突变除引起视网膜母细胞瘤外，还与骨肉瘤、纤维肉瘤、肺癌、乳癌、膀胱癌等的发生有关。,2、P53 最初发现p53时认为是一种癌基因，具转化活性，但到1989年证实，野生型p53为一肿瘤抑制基因，原来所发现的为突变型p53。 P53基因全长20kb，由11个exon构成，mRNA2.8kb，编码产物由393个氨基酸残基组成，亦可与多种DNA病毒产物结合。 P53的生化功能尚未完全明确，具有负性调节作用，且对apoptosis有抑制作用。 3、其他 NF1基因产物（neurofibromatosis type 1） WT1（肾母细胞瘤基因） DCC（结肠癌缺失基因）等,五、促癌基因 肿瘤发生发展分两阶段：起始和促发阶段；促癌基因能促进促发阶段的进程。目前已从小鼠皮肤上皮细胞（JB6）中分离到两种：pro-1和pro-2。 六、转移基因和转移抑制基因 1、转移基因（metastasis gene/metastogene）:指引起或加强转 移表型的基因。 2、转移抑制基因（metastasis suppressor gene）：指抑制转移 形成的基因。 （1）nm23基因； （2）TIMP-1,2（金属蛋白酶抑制物）。,七、癌基因与癌变的多阶段性 （一）正常细胞转化为恶性细胞可能需要多个癌基因的作用 例如；Ha-ras虽可使NIH/3T3转化，但却不能使第二代培养的大鼠成纤维细胞（REF）转化，如Ha-ras和myc或大T抗原基因一起转染REF，则可使之转化。 （二）多次突变与癌基因的致瘤作用 v-onc要克服正常细胞的调节机能，完全引起恶性转化，自身必须经历多次遗传学改变。 如v-rel感染宿主时伴有gag基因大片丢失，如丢失部分恢复，则病毒在宿主内能复制，但不具转化活性，但如在重组病毒的gag区造成第二次丢失或插入，使其不能合成gag蛋白，则病毒又恢复了转化能力,（三）癌基因和抑癌基因分别参与癌变的不同阶段 癌变是多阶段或多步的复杂过程，不同肿瘤经历的阶段可能不一样；在不同肿瘤形成的不同阶段，涉及的癌基因及抑癌基因可以不同。以直结肠癌为例：Fearon and Vogelstein分六阶段： 上皮过度增生 早、中、晚期腺瘤 腺癌 转移癌 从正常上皮 增生上皮：APC基因丢失或突变； 早期腺瘤 中、晚期腺瘤：k-ras突变、DCC丢失、p53突变。,Summary： 近年来对癌变分子生物学的研究，发现癌变涉及多个基因的改变，既有癌基因的作用又有抑癌基因的失活，甚至还有促癌基因或转移抑制基因的参与，情况十分复杂。 但随着时间推移，癌变过程的分子基础必将真相大白，并最终攻克 癌症这一课题。,细胞凋亡调控障碍 细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性死亡（programmed cell death, PCD）是一种由基因调控的主动有序的细胞死亡过程。,细胞凋亡的生物学特征 一、形态学改变 最早期形态学改变是细胞间的间接丢失 与邻近细胞脱离并失去微绒毛 胞浆浓缩及核质密度增高 （DNA断裂） 调亡小体 识别、吞噬（无炎症反应）,二、生化改变 1、染色质降解（chromatin degradation） 几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂 解，导致DNA 的断裂； DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋 白和其它核蛋白的降解； 染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞 和形态改变的基础； DNA fragmentation是凋亡的“golden marker”。,2、钙离子： 凋亡细胞出现最早的、可检测的改变是细胞内钙离子浓度快速/持续性升高。升高的钙通过激活核酸内切酶而引起DNA fragmentation。 3、PKA/PKC： 细胞内cAMP升高诱导凋亡，cAMP作用由PKA介导。PKC具有双重性，与其不同的同工酶有关PKC-1、PKC-促进凋亡，而PKC-则能抑制凋亡。,4、RNA/蛋白质合成： 凋亡过程伴有RNA/蛋白质等大分子的合成，说明凋亡是一种主动、耗能的过程，其发生与某些基因的表达变化有关。 5、Endogenous endonuclease: 正常细胞内存在，但无活性，凋亡时被激活，是Ca2+/Mg2+依赖性endonuclease。,三、分子水平的改变 发现一系列与凋亡相关的基因或基因家族，如ced、caspases、Bcl-2、p53等。,细胞凋亡的生物学意义,1.发育 从低等动物到高等动物的发育，都 存在着程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)的现象。 2.免疫系统 淋巴细胞发育分化成熟过程中， 始终伴随着细胞凋亡。 3.衰老 细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直 接或间接的联系。 4.损伤与修复 5.肿瘤发生 细胞增殖与死亡的速度平衡失 调。 6.病毒致病 病毒表达抗凋亡蛋白。,细胞凋亡的诱导因素,生理活性因子：TNF家族(Fas-L,TNF)、 TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长 因子撤退、GC等 损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等 化疗药物 毒素：乙醇、 -淀粉样肽,细胞凋亡的抑制因素,凋亡相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。 生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等 病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等 药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等,细胞凋亡的调控 凋亡过程中有许多基因表达明显改变。有些对凋亡由促进作用，而另一些则有抑制作用。 一、bcl-2 family 1、bcl-2：1984年于滤泡性淋巴瘤中分离 出的一种癌基因，表达产物位于线粒体 内膜及核膜，对凋亡由抑制作用。,(1) bcl-2转基因小鼠：expansion of B cells with prolonged survival without