细胞基质与内膜系统.ppt

第六章 细胞基质与内膜系统,第一节 细胞质基质 第二节 内质网 第三节 高尔基复合体 第四节 溶酶体 第五节 过氧化物体 第六节 蛋白质分选与膜泡运输,本章学习的目的,1、了解真核细胞区室化(compartmentation) 2、掌握内质网、高尔基复合体、溶酶体、过氧化酶体的结构和功能及相互关系 3、蛋白质合成后的修饰途径及部位 4、蛋白质分选的类型 5、膜泡运输的途径及机制,第一节 细胞质基质(cytosol),1.溶胶:除去可辩识细胞器后的胶态物 2.组成:各种酶,胞质骨架 3.胶体是蛋白质同水分子形成的水合物 4.高度有序,5.细胞质基质的基本功能 1)中间代谢的场所。糖酵解、磷酸戊糖途径、糖醛酸途径、糖原合成 2)为细胞器提供所需离子环境 3)为细胞器行使功能提供底物。 4)细胞质骨架：提供锚定位点，各种组分区域化. 5)参与蛋白质修饰、选择性降解等,第二节 内质网,Porter等1945年观察小鼠成纤维细胞时，发现细胞质内部具网状结构，称内质网endoplasmic reticulum，ER. ER常和质膜及核膜相连，并与高尔基体关系密切，并常伴有许多线粒体。,一、ER的形态,ER膜是细胞中最多的膜，占总膜面积一半。 ER是内膜封闭成的网状管道系统，具多型性。 膜围成的ER腔是连通的。 分糙面型内质网(RER)和光面型内质网(SER)。,RER呈扁平囊状，排列整齐， 有核糖体附着,SER呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。,RER功能是合成各种蛋白，分泌旺盛细胞中较多，未分化细胞和肿瘤细胞中较少。 SER是脂类合成场所，常为出芽位点，将合成的proteins和lipids运到高尔基体 SER是ER管道网络的一部分,肌质网 (sacroplasmic reticulum),肌细胞中特化SER。膜上的Ca2+-ATP酶将胞质中的Ca2+泵入腔中储存，使肌质网中Ca2+浓度比胞质中高出千倍。受神经冲动的刺激时，Ca2+释放入胞质中，引起肌肉收缩。,二、 ER的组成,ER膜含约60%蛋白和40%脂类，脂中磷脂酰胆碱含量高，鞘磷脂含量低，胆固醇少。 ER约有30多种膜结合蛋白，30多种位于内质网腔。标志酶是葡糖-6-磷酸酶。 核糖体结合糖蛋白只分布在RER. P450酶系只分布在SER。,RER膜上有易位子(translocon)，直径约8.5nm，有2nm通道，与新合成多肽转运有关。 细胞匀浆时，由破碎ER形成的近球型的囊泡结构,称为微粒体(microsome)，含ER膜与核糖体。研究中将其与ER等同对待。,三、ER的功能,合成蛋白质和脂类。分泌蛋白和跨膜蛋白都在ER合成。 合成的脂类除满足自身需要，还供给高尔基体、溶酶体、内体、质膜、线粒体、叶绿体等膜性细胞结构。,(一)SER的功能,SER具许多功能，如糖原分解，类固醇激素合成，脂肪合成与转运，肝细胞解毒，肌肉收缩等 。,1、糖原分解释放游离的葡萄糖,ER中，G-6-Pase能催化G-6-P水解生成葡萄糖和磷酸。 肝细胞功能之一是维持血液Glu的衡定：肝细胞SER表面附有糖原颗粒，肌体需Glu时，糖原被转化为G-1-P，变为G-6-磷酸。膜对磷酸化糖不通透，G-6-P去磷酸化后才穿过质膜，进入血液。,2、类固醇激素的合成,分泌类固醇激素的肾上腺细胞、黄体细胞等都有丰富SER。SER上分布有合成胆固醇和转化胆固醇为激素的全套酶系，合成胆固醇，并将其氧化、还原、水解成各种类固醇激素。,3、脂的合成与转运,SER是脂类合成主要场所。甘油三酯是由SER合成并贮存ER腔中。 细胞膜所需的膜脂全都在SER合成， SER上有合成磷脂所需的酶。 SER合成的磷脂由胞质面转向ER腔面，转位由ER膜中翻转酶帮助完成。,SER合成磷脂向其它膜结构转运的2种方式：,1. 通过水溶性载体蛋白-磷脂交换蛋白(PEP)，在膜结构间转移磷脂：PEP与磷脂结合形成水溶性复合物进入cytosol，扩散遇上其它膜后，PEP释放磷脂，将它插在膜上。 2. 以出芽方式将磷脂转运到高尔基体、溶酶体和细胞膜。,4、解毒作用,SER独特功能是对农药、污染物、毒素等有毒物进行解毒。反应在肝细胞SER进行，故称肝细胞的解毒作用。 Cyt P450是肝细胞SER的膜蛋白，属单加氧酶，或羟化酶。它催化O2中的1个氧原子加到不溶于水的废物上使之羟化，溶于水并被转出细胞；另一氧原子被NADH还原成水。,5、钙离子的调节作用,肌细胞有发达的肌质网,是肌细胞钙库,含钙结合蛋白,1个钙结合蛋白结合30个左右Ca2+ 。 细胞受刺激时，肌质网中Ca2+释放进入胞质，参与信号传递；信号消除时， Ca2+又被肌质网上的Ca2+-ATPase泵回腔中。 多数真核细胞中，ER是主要Ca2+库之一。且ER膜上有三磷酸肌醇(IP3)的受体。,（二）RER的功能-蛋白质转运,蛋白质都在核糖体合成，但都起始于cytosol，有些在合成不久转到ER合成，这些蛋白主要有： 分泌蛋白、如激素； 跨膜蛋白，并决定膜蛋白在膜中排列方式; 需严格分开的酶，如溶酶体的水解酶； 需进行修饰的蛋白，如糖蛋白。 有些核糖体在合成蛋白质时一直保持游离状态,主要合成可溶性胞浆蛋白,膜外周蛋白和锚定蛋白,过氧化物酶体蛋白,核蛋白等.,在ER核糖体上合成的蛋白质与在游离核糖体上合成的蛋白质的种类和去向不同 为什么会有这种不同?或为什么有些核糖体要附着在ER上合成蛋白质?是什么原因决定了核糖体在合成蛋白质时是游离还是附着到ER？ 为此科学家进行了大量研究,1. 膜结合核糖体合成的蛋白质能跨ER膜进入ER腔,60s，Redman用RER小泡研究膜结合核糖体合成的蛋白质是否会进入RER腔。 将RER小泡置加放射性标记aa的蛋白质合成体系中短暂温育，再加嘌呤毒素，蛋白质合成提前终止,从核糖体上释放不完全多肽 收集RER小泡，去垢剂破坏,分析表明，RER小泡中释放的多肽含放射性标记 证明新合成的多肽能跨过ER膜进入ER腔,2.信号序列的提出,是什么原因指导这些多肽跨过ER膜的呢？ 1971年美国Blobel等提出了两点推测： 1）分泌蛋白的N端含一段特别的信号序列可将多肽和核糖体引导到ER膜上； 2）多肽通过ER膜上的转运蛋白进入ER腔，并在合成的同时转移。,3. 信号序列存在的实验证据,72年，Milstein等用无细胞系统合成IgG轻链时，获得了信号序列存在的直接证据。 在无细胞体系中用编码IgG轻链的mRNA指导合成多肽，合成的多肽比成熟的IgG在N端多出一段肽链，有20个aa，推测，这段肽具信号作用，使IgG透过ER并继而分泌到细胞外。 Blobel等用微粒体和无细胞体系进行大量研究，证实了信号序列的存在。,(1)在无细胞体系中加与不加RER小泡，蛋白质合成的产物不同： 将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中翻译时，如不加RER小泡，获得的翻译产物的长度比从细胞中分泌出的蛋白质长。如在这种无细胞体系中添加RER小泡，翻译产物与从细胞中分泌出来的蛋白质长度相同。因此推测信号序列在引导蛋白质进入内质网后被切除了。,(2)蛋白水解酶实验证明多肽在合成的同时就开始向ER转运： 在分泌蛋白进行体外翻译的无细胞体系中(含有RER小泡)加蛋白水解酶，不能使新合成多肽水解。如同时加入去垢剂，则能将蛋白质水解，说明新生肽链是边合成边运输的。,4. 信号序列的一般特征及信号假说,Blobel还发现信号序列具共同特性： 一般为15-35个aa残基，N端含有1或多个带正电荷的aa，其后是6-12个连续的疏水aa； 这些信号序列在蛋白质合成时将核糖体引导到ER，进入ER后被切除。 1975年，Blobel正式提出信号假说,信号假说的要点： 1)蛋白的合成起始于胞质中游离核糖体 2)N端信号序列露出核糖体后，靠自由碰撞与ER接触，N端信号序列的疏水性插入ER膜中； 3)蛋白质继续合成，以絆环形式穿过ER膜 4)如果是分泌蛋白，除信号序列被信号肽酶切除外，全部进入ER腔；若是膜蛋白，则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在ER膜上。,Blobel提出的信号假说，揭示了细胞中不同蛋白质在合成后如何找到自己的工作岗位，发现了蛋白质与生俱来的“地址标签”。 该发现开辟了一个全新的医学、细胞生物学和分子生物学研究领域，为此获得1999年诺贝尔医学/生理学奖。,5. 新蛋白复合物发现对信号假说补充,81年，Blobel等发现在核糖体与ER结合过程需几种蛋白质复合物的参与。 该发现明确了信号序列同核糖体结合的细节 第1个复合物是信号识别颗粒(signal recognition particle，SRP)。是1种核糖核蛋白复合体，沉降系数11S，含6条不同肽链和一个7SRNA,SRP有3个功能部位：翻译暂停结构域，信号识别结合位点，SRP受体蛋白结合位点。 SRP能识别游离核糖体上合成的信号肽，并结合，暂时中止新生肽的合成；同时SRP与ER上的停靠蛋白(docking protein，DP)结合，使核糖体附着到ER膜，并进行新生肽的转移。 SRP对没有信号序列的蛋白质不起作用。,6.蛋白质的共翻译转运机制:信号假说,经补充的信号假说更合理，核心内容： 核糖体同ER的结合受制于mRNA中特定密码序列(可翻译成信号肽)，具这种密码序列的新生肽才能同核糖体一起附着到ER膜特定部位。 信号序列有两个基本的作用： 1.与SRP的识别和结合,引导核糖体与ER的结合 2.通过信号序列的疏水性,引导新生肽跨膜转运,7. 蛋白质共翻译转运的机理,RER上合成的蛋白质有2类: A、分泌蛋白在ER合成后对信号肽的切除，可释放到ER腔，成可溶性蛋白，再进行下游运输。 B、膜蛋白的共翻译转运较复杂，先要靠疏水区滞留在ER膜上；同时膜蛋白分单次和多次跨膜，还有定向。 膜蛋白的转运同样可以用信号假说进行解释。,(1)起始转移信号,蛋白质N端的信号序列除作信号被SRP识别，还具起始穿膜转移作用。 在蛋白质共翻译转移过程中，信号序列的N端始终是朝ER外侧，插入转运通道后与通道内的信号序列结合位点(受体)结合，其后的肽序列是以伴环的形式通过运输通道。 N端的起始转移序列是可切除的。,(2)内部信号序列,不位于N端，但具信号序列作用。 可作蛋白质共翻译转运信号被SRP识别，同时也是起始转移信号，可插入转运通道，与通道中受体结合，引导多肽序列转运。 内部转移信号是不可切除的，同时又是疏水的，所以它是膜蛋白的一部分。,(3)终止转移肽与单次跨膜蛋白,跨膜蛋白的形成除与内部信号序列有关外，也与终止转移信号相关 终止转运信号位于新生肽中，是一段使肽链终止转移的信号序列。可使蛋白锚定在膜中。 单次跨膜蛋白在结构上只有一个终止转移序列，没有内部转移信号，但是在N端有一个信号序列作为起始转移信号。,(4)二次跨膜蛋白与多次跨膜蛋白,二次跨膜就是在蛋白质中有两个跨膜的疏水区，含1个内部信号序列和1个终止转移信号。 多次跨膜蛋白有多个跨膜的疏水区，含多个起始跨膜信号序列与多个终止转移信号。,概括起来: 新生肽是否含终止转移信号决定了新生肽是成为可溶性蛋白还是膜蛋白。 N端信号序列和内部信号序列都可作起始转移信号,N端信号序列可切除,内部信号序列不可切除 跨膜蛋白的跨膜次数是由内部信号序列和终止转移信号序列的数目决定的 信号序列都是疏水aa区,可视多肽链中疏水aa区的数目和位置推测其跨膜情况,蛋白质转入内质网上合成的要素及具体过程的总结,(1) 要素: 至少涉及4种成分,信号肽: 引导新合成肽链转移到ER上一段多肽,也是引导肽链进入ER腔序列,又称开始转移序列 信号识别颗粒(SRP): 与信号序列结合,导致蛋白质合成暂停. SRP受体: ER膜整合蛋白,与SRP特异结合,使核糖体泊定在ER上. 终止转移序列: 肽链上一段特殊序列,与ER亲合力高,阻止肽链释放到ER腔,使其成跨膜蛋白。,(2) 具体过程,游离核糖体开始合成蛋白质信号肽与SRP结合肽链延伸终止SRP与ER上的受体结合SRP脱离信号肽肽链在ER上继续合成，同时信号肽引导新生肽链进入ER腔信号肽切除肽链延伸至终止翻译体系解散。 这种肽链边合成边向ER腔转移的方式，称为cotranslation(共翻译转运)。,蛋白质转移到内质网上合成的过程,8. Bip蛋白在ER蛋白质转移和装配中的作用,进入ER腔中蛋白很快与Bip蛋白结合。Bip是IgG重链结合简称，是一类分子伴侣，属Hsp70家族 Bip同进入ER蛋白的疏水aa结合，防止肽链不正确折叠和聚合，然后Bip同ATP结合，并通过ATP的水解释放出结合的多肽。释放的多肽很快折叠，或同别的亚基组装成完整的蛋白质。 正确折叠和装配的蛋白不会同Bip再结合，但如折叠或装配不正确，Bip马上同其结合。,9.蛋白质在ER中的修饰,新生肽进入ER腔后除要正确折叠外，还要进行各种修饰后才运送到其它部位。 这些修饰包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有ER上合成的蛋白质最终被糖基化。,1) 蛋白质糖基化(glycosylation)有2种： (1)N-糖基化:主要在ER进行.糖为N-乙酰葡糖胺，糖供体为核苷糖，如GDP-甘露糖。糖分子先被糖基转移酶转到膜中的磷酸长醇，再被寡糖转移酶转到肽链特定序列(Asn-X-Ser/Thr)Asn上 (2)O-糖基化:糖为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺,与Ser、Thr和Hyp的OH连接. O-连接糖基化在高尔基体进行.,N-连接的糖基化,2）羟基化：在合成胶原蛋白时，Pro和Lys都需羟基化。 3）形成脂锚定蛋白：新合成的蛋白质除成为跨膜蛋白或可溶性蛋白外，有的还通过酰基化同ER上的糖脂结合，将自己锚在ER膜上。,第三节 高尔基复合体 (Golgi complex),又称高尔基体(Golgi body,Golgi apparatus)，1898年Golgi用银染法在猫头鹰的神经细胞内观察到，定名为高尔基体 真核细胞中普遍存在。大多数共翻译转运的蛋白质进入ER后都要通过膜运输机制转运到其它部位，第一站就是高尔基体,培养的上皮细胞中高尔基体的分布（高尔基体为红色，核为绿色）,一、高尔基体的形态结构和极性,1. 形态结构 由数个扁平囊泡堆在一起。扁平囊泡呈弓形或半球形。主要包括3种结构组分： 扁平膜囊堆:高尔基体主体部分,48个扁平囊平行排列,单层膜构成,中间为囊腔,周缘呈泡状。 液泡:又称分泌泡或成熟泡,扁平膜囊扩大末端,与物质的成熟运输有关。 小泡:扁平膜囊周围有许多小泡，多集中在形成面，是来自ER的分泌泡。,2. 高尔基体的极性,高尔基体不同的膜囊具不同功能。分3个区隔: 靠近细胞核的一面,是管状囊泡形成的网络结构，称为形成面、顺面或内侧面(cis face)。其网络结构称为高尔基体内侧网络(cis Golgi network,CGN) 中间膜囊：由扁平膜囊和管道构成 对着质膜的一面称成熟面、反面或外侧面(trans face).外侧面也是一个网络，称外侧网络(TGN),高尔基体的三个功能区域,高尔基体各部分的名称,高尔基复合体的极性( polarity),3. 各区隔的功能,内侧面网络(CGN)：为高尔基体的入口区，是初级分选站，接受由ER合成的物质，并分类后转入中间膜囊。 中间膜囊：是糖基修饰、糖脂形成及糖合成部位 外面网络(TGN)：是高尔基体的出口区，蛋白质分选信号在此被特异性受体接受，进行分类、集中，形成不同分泌小泡，最后输出,可用细胞化学研究不同区隔的结构和功能： 高尔基体的cis面膜囊具嗜锇性； 高尔基体trans面的膜囊能被焦磷酸硫胺素酶(TPP酶)的细胞化学反应显示； 高尔基体中间膜囊能被烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶(NADP酶)的细胞化学反应显示,高尔基体的三个不同功能分区: 高尔基体顺面具很强的嗜锇性;而进行蛋白质糖基化的甘露糖甙酶主要位于高尔基体的中间膜囊;而核苷二磷酸的酶主要位于高尔基的反面,4. 高尔基体的化学组成,高尔基体膜含60%蛋白和40%脂类，具一些和ER共同的蛋白成分。膜脂中的磷脂含量介于ER和质膜之间。 高尔基体的膜上含丰富的酶类，主要包括：糖基转移酶、氧化还原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、转移酶和磷脂酶. 标志性酶是糖基转移酶,5. 数量和分布,只存在于真核生物. 各种细胞中含高尔基体数量不等,平均20个,低等真核生物中有的仅1-2个,有的多达上万个 分泌旺盛的细胞中高尔基体很多,而肌肉细胞和淋巴细胞中则较少见,二、高尔基体主要功能,将ER合成的蛋白质进行加工、分类与包装,分门别类地送到细胞特定部位或分泌到细胞外。 1. 蛋白质的糖基化: N-连接的糖链合成始于ER，完成于高尔基体。 许多糖蛋白还具O-连接的糖链。O-连接的糖基化在高尔基体中进行。 高尔基体可将多个氨基聚糖链通过木糖连接在核心蛋白丝氨酸残基上，形成蛋白聚糖。,N连接的糖基化开始于RER,而后在高尔基体中进行不同的修饰,2、参与细胞分泌活动 负责对ER合成的蛋白质进行加工，分类，并运出，其过程可概括为： RER上合成蛋白质进入ER腔以出芽形成囊泡进入CGN在medial cisternae中加工在TGN形成囊泡囊泡与质膜融合、排出。 运输过程还有另外一种假说：潴泡成熟假说,高尔基体与细胞分泌,组成型分泌,调节型分泌：受细胞外信号调节,高尔基体对蛋白质的分类，是由蛋白质上的信号肽与受体间的相互作用而决定。 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu-coo-)序列是ER滞留信号，高尔基体将把其押回ER。 其它不同部位的蛋白都具不同的滞留信号，分选包装到不同的运输小泡。 没有特别信号的将进入非特异的分泌小泡,3. 进行膜的转化：高尔基体膜的厚度和化学组成都介于ER和质膜间，因此高尔基体在进行着膜转化的功能. 4. 将蛋白水解为活性物质: 有些分泌蛋白在ER合成后是蛋白原，送到高尔基体后被水解，形成成熟的分泌蛋白。如胰岛素合成 5、参与形成溶酶体。 6、参与植物细胞壁的形成。 7、合成植物细胞壁中的纤维素和果胶质。,第四节:溶酶体(lysosome),1955年de Duve首次用电镜观察到了溶酶体。 一、溶酶体的形态 溶酶体是动物细胞的膜性细胞器，由单层膜包被，含多种酸性水解酶，主要进行细胞内消化 是一种动态结构，同类型细胞中形态大小不同，同一细胞不同发育阶段也不同 植物细胞中也有类似溶酶体的细胞器，如圆球体，糊粉粒和中央大液泡等,二、溶酶体的结构类型,具异质性，不同来源的溶酶体在形态、大小及内含的水解酶种类都不同，标志酶为酸性磷酸酶(acid phosphatase) 。 依完成生理功能的不同阶段可分： 初级溶酶体(primary lysosome)； 次级溶酶体(secondary lysosome)； 残体(residual body)。,Primary lysosomes：初级溶酶体；Second lysosomes：次级溶酶体 heterophagic：异噬性； autophagic：自噬性；Residual body：残体,对溶酶体的标志酶酸性磷酸酶定位显示: 大的膜细胞器含有浓密的铅沉淀，是溶酶体; 两小的可能是来自于高尔基体的含酸性水解酶的小泡。,1、初级溶酶体 (primary lysosome),呈球形，直径0.20.5um，内含物均一，无明显颗粒，由高尔基体分泌形成。 含多种酸性水解酶，但没活性，只有当溶酶体破裂，或其它物质进入，才有活性。 水解酶包括：蛋白酶，核酸酶、脂酶、磷酸酶、硫酸酯酶、磷脂酶类，约60余种，均属酸性水解酶，最适pH值约为5。,溶酶体膜与其它生物膜有明显的不同： 膜有质子泵，将H+泵入溶酶体，形成和维持酸性内环境。 膜蛋白高度糖基化，防止自身膜蛋白被降解。,初级溶酶体,溶酶体和内体中的低pH值: 用一种对pH敏感的荧光探针标记蛋白质,然后让这种蛋白质通过细胞内吞,可以用以探测溶酶体和内体中pH值.不同的颜色反映了不同的pH值。 在溶酶体中(红色)的pH值约为5； 而内体中(兰色和绿色)pH从5.5到6.5。,2、次级溶酶体(secondary lysosome),是初级溶酶体与吞噬泡融合后形成的消化泡，是正在进行消化的溶酶体，内含水解酶和相应底物 根据底物来源的不同，又可分为2种类型: 异噬溶酶体(phagolysosome): 消化的物质是经吞噬或胞饮所摄入的细胞外物质 自噬溶酶体(autophagolysosome): 消化的物质来细胞内蜕变、破损的细胞器或局部细胞质。,次级溶酶体,3、残体,又称后溶酶体(post-lysosome)已失去酶活性，仅留未消化的残渣。 残体可通过外排作用排出细胞，也可能留在细胞内逐年增多，如肝细胞中的脂褐质。,肝细胞中的脂褐质,三、溶酶体的功能,主要进行细胞内消化，与细胞防御及自溶有关 异体吞噬及防御作用：通过溶酶体的作用，保护细胞免受细菌与病毒的浸染，多细胞动物具专门的吞噬细胞。 自体吞噬: 是溶酶体对细胞自身结构的吞噬降解,清除无用的生物大分子，受损及衰老细胞器等，也为细胞器的构建提供原料 自溶作用(autolysis)：是细胞的自我毁灭，即溶酶体将酶释放出来将细胞自身全部降解,其它一些功能: 细胞凋亡：注定要消除的细胞出芽形成凋亡小体，被巨噬细胞吞噬并消化。 为细胞提供营养物: 内吞并降解LDL获得胆固醇 参与分泌调节: 如将甲状腺球蛋白降解成有活性的甲状腺素。 形成精子顶体：顶体释放出溶酶体酶，溶解卵子的外被及滤泡细胞,产生通道,使精子进入卵细胞,溶酶体的功能,四、溶酶体的发生,初级溶酶体是在高尔基体的trans面以出芽方式形成，其形成过程: RER上合成溶酶体蛋白ER腔糖基化修饰高尔基体Cis面膜囊N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶识别溶酶体水解酶的信号斑将N-乙酰葡糖胺磷酸转移在12个甘露糖残基上在中间膜囊切去N-乙酰葡糖胺形成M6P配体与trans膜囊上M6P受体结合选择性地包装成初级溶酶体。,Biogenesis of Lysosomes,M6P途径: 溶酶体酶运输主要途径,溶酶体酶前体从RER运到高尔基体顺面，在那里甘露糖残基被磷酸化。 在TGN, 磷酸化的酶结合到M6P受体, 受体指导酶进入网格蛋白有被小泡。 网格蛋白解离成无被小泡，与初级内体融合。 低pH下，酶从M6P受体上解离，脱磷酸化。 受体再循环回到高尔基体, 酶进入运输泡，运输泡由次级内体出芽形成，和溶酶体融合,五、内体（endosome）,细胞内一种膜结合细胞器，有初级内体(early endosome)和次级内体(late endosome) 主要特征是酸性、但不含溶酶体酶 初级内体是由内吞形成的含内吞物的膜结合细胞器，是指状或小泡状的网络结构集合体 次级内体呈酸性，具分拣作用，能分选结合物的受体，让受体再循环到质膜或高尔基体,六、溶酶体与疾病,1. 矽肺(silicosis):石末沉着病，磨工病 SiO2尘粒吸入肺泡被巨噬细胞吞噬，含矽尘的吞噬体与溶酶体融合。吞噬的SiO2不能消化，且表面形成硅酸，硅酸的羧基与溶酶体膜脂或蛋白形成氢键，导致吞噬细胞溶酶体崩解，细胞破坏，矽尘释出，又被其它巨噬细胞吞噬，如此反复。 受损或破坏的巨噬细胞释放“致纤维化因子”，激活成纤维细胞，导致胶原纤维沉积，肺组织纤维化，弹性降低，呼吸功能下降,2. 各类贮积症(storage disease):由遗传缺陷引起，溶酶体酶发生变异，功能丧失，底物在溶酶体中贮积，影响细胞功能，常见的贮积症有： (1)台-萨氏综合症(Tay-Sachs diesease)：又称黑蒙性家族痴呆症，溶酶体缺氨基已糖酯酶A,导致神经节苷脂GM2积累，影响细胞功能。 患者表现为渐进性失明、痴呆和瘫痪，26岁死亡。主要出现在犹太人群中。,台-萨氏综合征神经元中同心圆状的溶酶体,(2) II型糖原累积病(Pompe病)：常染色体缺陷遗传病.溶酶体缺-1,4-葡萄糖苷酶，糖原在溶酶体积累，使心肝舌肿大和骨骼肌无力。 患者多为小孩,两周岁前死亡 (3) Gaucher病:脑苷脂沉积病,巨噬细胞和脑神经细胞的溶酶体缺乏- 葡萄糖苷酶造成。葡萄糖脑苷脂沉积在溶酶体,巨噬细胞变成Gaucher细胞 患者肝脾淋巴肿大，中枢神经发生退行性变化，常在1 岁内死亡。,神经鞘脂贮积病,(4)细胞内含物病(inclusion-cell disease，I-cell disease)：严重的贮积症，N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶单基因突变引起，导致高尔基体中加工的溶酶体酶不能形成M6P分选信号，酶被运出胞外。 病人成纤维细胞溶酶体中没水解酶，使底物在溶酶体中大量贮积，形成“包涵体(inclusion)”。 病人肝细胞中有正常的溶酶体，说明溶酶体形成还具M6P之外的途径。,3. 肺结核：结核杆菌不产生内、外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。但菌体成分硫酸脑苷脂能抵抗胞内的溶菌酶，使结核杆菌在肺泡内大量生长繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出的结核杆菌再被吞噬，最终引起肺组织钙化和纤维化 4. 类风湿性关节炎：溶酶体膜很易脆裂，其释放的酶导致关节组织损伤和发炎 。,第五节 过氧化物酶体(peroxisome),一、形态结构 过氧化物酶体又称微体(microbody)，由 Rhodin (1954)首次在鼠肾小管上皮细胞中发现。 具异质性，在不同生物及不同发育阶段不同。直径约0.21.5um，由单层膜围绕而成。 普遍存在于真核细胞，肝、肾细胞尤丰富,共同特点是含1至多种依赖于黄素(flavin)的氧化酶和过氧化氢酶，已发现40多种氧化酶，以尿酸氧化酶(urate oxidase)含量高，有些种类形成酶结晶构成的核心。 标志酶为过氧化氢酶，作用是将H2O2水解 过氧化物酶体与溶酶体不同，不是来源于ER和高尔基体。,人肝细胞过氧化物酶体(Ps，没有尿酸氧化酶结晶),烟草叶肉细胞的过氧化物酶体(中央具有尿酸氧化酶形成的晶体状核心),二、过氧化物酶体的功能,1. 防止细胞产生H2O2，对细胞起保护作用 各类氧化酶的共性是将底物氧化后，生成过氧化氢。RH2+O2R+H2O2 氢的过氧化物有毒，过氧化物酶体可通过两种方式消除细胞中的过氧化氢 (1) 过氧化氢酶可利用H2O2，将其它底物(如醛、醇、酚)氧化.反应为:RH2+H2O2R+2H2O (2) 过氧化氢酶亦直接使过氧化氢还原成水： 2H2O2 2H2O + O2,2. 使毒性物质失活 过氧化氢酶可利用H2O2氧化各种底物，如酚、甲酸、甲醛、乙醇等，使有毒物变成无毒物 这种作用对于肝、肾细胞尤为重要。人饮入的乙醇一半是以这种方式被氧化成乙醛。 3. 对氧的调节作用 细胞中的氧主要由2种细胞器消耗：线粒体和过氧化物酶体。低氧时，线粒体利用氧的能力比过氧化物酶体强；高氧时，过氧化物酶体的氧化反应占主导地位，使细胞免受高浓度氧的毒害,4. 脂肪酸的氧化 动物中过氧化物酶体参与了脂肪酸氧化，动物组织25-50%脂肪酸由过氧化物酶体氧化，其它由线粒体氧化。 大鼠在服用降脂灵后，肝细胞过氧化物酶体酶浓度升高10倍。 5. 含氮物质的代谢 尿酸是核苷酸和某些蛋白质降解代谢的产物，尿酸氧化酶可氧化去除这种代谢废物,在植物中过氧化物酶体主要作用有： 参与光呼吸，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢; 种子萌发时，进行脂肪-氧化，产生乙酰辅酶A，经乙醛酸循环，产生乙醛酸和琥珀酸，加入三羧酸循环，因涉及乙醛酸循环，又称乙醛酸循环体(glyoxysome)。,三、过氧化物酶体的生物发生,从系统发生角度看，过氧化物酶体可能是一种古老的细胞器，在光合生物出现后，大气中的氧含量逐渐提高，而氧对早期的生物具毒害作用，过氧化物酶体的功能是消除细胞内的氧，并产生细胞所需要的某些代谢物。 过氧化物酶体中黄素蛋白、氧化酶和过氧化氢酶间可形成简单的呼吸链，但没能量转换功能。线粒体产生后取代了过氧化物酶体的这种功能，且电子传递与ATP合成相偶联,从个体发生角度看，过氧化物酶体来源于已存在过氧化物酶体的分裂。 过氧化物酶体中所有的酶都由核基因编码，在cytosol中合成，由信号肽 (-Ser-Lys-Leu-COO-)引导，进入过氧化物酶体。 Zellweger综合症是与过氧化物酶体有关的遗传病，也叫脑肝肾综合症，患者过氧化物酶体中，酶蛋白输入有关的蛋白变异，过氧化物酶体是“空的”。脑、肝、肾异常，出生3-6月死亡,第六节: 蛋白质分选与膜泡运输,哺乳动物细胞中可检出的蛋白质达1-2万种，除少数在线粒体和叶绿体合成外，绝大多数都在核糖体合成，然后通过特定机制转运到细胞特定部位。该过程称蛋白质定向运输(protein targeting)或分选(protein sorting).,一、蛋白质分选的基本途径与类型,蛋白质分选有2种途径： 在cytosol中完成多肽链合成，转运到cytosol特定部位和一些细胞器：细胞核、线粒体、叶绿体、过氧化物酶体 蛋白质在RER合成，经高尔基体运至溶酶体、细胞质膜或细胞外，ER和高尔基体自身的蛋白成分也由这条途径完成,依蛋白类型和运输方式，又将蛋白质分选分为4种类型： 1. 蛋白质跨膜转运：cytosol中合成的蛋白质转运到ER,线粒体,质体和过氧化物酶体. 2. 膜泡运输：通过运输小泡进行运输 3. 选择性门控转运：指cytosol中合成的蛋白通过核孔复合体选择性地进出细胞核 4. cytosol中蛋白质转运,蛋白质分选途径,二、蛋白质分选信号,细胞内至少有两类蛋白质分选信号： 1. 信号序列：蛋白质一级结构中的线性序列. 2. 信号斑(signal patch)：蛋白质折叠时，不相邻信号序列折叠在一起构成信号斑,了解较少 信号序列决定特定蛋白的转运方向：输入ER的蛋白质N端有一段信号序列；由高尔基体返回ER的蛋白质，C端的KDEL序列。,两类分选信号,一些典型的分选信号,三、膜泡运输,细胞必须具精密而有效的机制，确保RER合成的各种蛋白，在高尔基体TGN通过形成不同的转运泡被分选转运，各就各位，发挥其功能。 膜泡运输是蛋白质运输的一种特有方式，普遍存在于真核细胞，除蛋白质加工修饰外，还涉及各种不同膜泡定向运输及复杂的调控过程,运输小泡是在膜的特定区域以出芽方式产生。表面有一个由蛋白质构成的衣被(coat)。 衣被有2个主要作用： 选择性地将特定蛋白聚在一起，形成运输小泡 如同模具一样决定运输小泡的外部特征，使相同性质的运输小泡具相同的形状和体积。,(一)有被小泡及其类型,细胞分泌和内吞过程，膜上形成的小泡常由不同蛋白质包被，称有被小泡(coated vesicles)，已发现有3种类型的有被小泡具物质运输作用。 1. 网格蛋白有被小泡(calthrin-coated vesicles)：从高尔基体TGN出芽形成的选择性分泌小泡，包括溶酶体酶运输小泡及细胞质膜由受体介导的内吞泡，都是由网格蛋白参与形成，这些小泡表面都包裹着一层聚合的网格蛋白,第二种类型是COP被膜小泡，它是介导非选择性运输的一种小泡。这种小泡参与从ER到高尔基体内侧网络，从高尔基体内侧网络到中间膜囊、从中间膜囊到高尔基体TGN网络的运输。这种小泡表面包裹的是外被蛋白 (coat protein )，外被蛋白是一个大的复合体，称为外被体(coatmer),第三种类型是COP被膜小泡，负责回收、转运ER逃逸蛋白(escaped proteins)返回ER，包括从高尔基体外侧网络运向内侧，以及将蛋白质从高尔基体内侧运回ER。 3种类型的小泡不仅外被蛋白不同，小泡形成时所需要的小GTP结合蛋白和衔接蛋白也不相同。 但是三者在小泡的形成方式和所需要的基本成分是基本一致的,(二)小泡运输的分选信号,3种不同类型运输小泡的形成和定向运输都是由信号指导的。 如KDEL信号是ER蛋白的滞留信号，因此KDEL是COP被膜小泡形成的信号。 小泡形成不仅需信号,同时也需衔接蛋白和信号受体。,KDEL序列,（三）网格蛋白有被小泡形成的机制,网格蛋白有被小泡介导高尔基体到内体、溶酶体、液泡的运输，及质膜到内膜区隔的膜泡运输 1、网格蛋白(clathrin)及包被亚基：进化上高度保守，1条重链和1条轻链组成二聚体。 三个二聚体形成包被的基本单位三脚蛋白体。 多个三脚蛋白体再组装成五边或六边形网格结构:包被亚基。再由亚基组装成网格蛋白小泡,笼形蛋白的结构，A电镜照片，B分子模型，C衣被模型,2、衔接蛋白(adaptin)和发动蛋白(dynamin)： 在网格蛋白被膜小窝形成时，网格蛋白和膜之间有一种蛋白质起衔接作用，即是衔接蛋白。是在网格蛋白有被小泡形成时起中介作用的蛋白质。 已发现4种不同类型衔接蛋白，可分别结合不受体，形成不同性质转运小泡，如AP1参与高尔基体内体的运输、AP2参与质膜内体的运输、AP3参与高尔基体溶酶体运输,在网格蛋白有被小泡形成时，还需发动蛋白的参与。发动蛋白是一种胞质溶胶蛋白，能同GTP结合并将其水解。 发动蛋白在被膜小窝的颈部聚合，通过水解GTP调节自己收缩，将小泡与膜割开。,3、网格蛋白有被小泡的形成和运输机制： 网格蛋白有被小泡的形成可分3个过程： 形成网格蛋白被膜小窝(pit):内吞时，吞入物首先同表面受体结合，然后网格蛋白装配的亚基结合上去，诱导膜凹陷形成小窝。 形成网格小泡:在被膜小窝形成处，以出芽方式形成小泡，在发动蛋白作用下与质膜割裂,成为网格蛋白有被小泡。 网格小泡形成后，很快脱去网格蛋白外被，成为无被小泡。,在TGN的网格小泡的形成,网格蛋白有被小泡的掐断过程,网格蛋白有被小泡的组成,网格蛋白有被小泡的形态,(四) COP被膜小泡的形成机制,COP是一种胞质溶胶蛋白，由7个亚基组成。COPI在出芽小泡的溶胶面聚合，形成被膜小泡 COPI小泡的形成也可分为3步： 一种胞质小GTP蛋白:装配反应因子(ARF)，释放GDP，结合GTP，形成ARF-GTP，并整合到高尔基体膜中。 COPI同ARF及高尔基体膜蛋白胞质区结合。 在脂酰CoA帮助下形成COPI被膜小泡.很快COPI包被开始去聚合，并与膜分离。,ARF被认为是COP外被装配和去装配的信号,在COP被膜小泡中起着重要的作用. ARF同GDP结合无活性,其脂肪酸的尾部隐藏在蛋白质空间结构中,不能和膜结合.结合GTP后,ARF构型改变,暴露出脂肪酸链,并插到供体膜中.同膜结合的ARF-GTP可同外被结合,形成被膜小泡. COPI介导的运输是从高尔基体到ER的回流.,COP I衣被小泡的形态,A model for the retrieval of ER resident proteins. The KDEL receptor captures the soluble ER resident proteins and carries them in COPI-coated transport vesicles back to the ER. Neutral pH: dissociate from the KDEL; low pH: binding the KDEL,3、COP小泡的形成： COPII介导ER到高尔基体的运输，小泡先在ER形成，其外被蛋白与COPI相似但不同。 COPII是多亚基复合物，亚基有Sec23/Sec24复合物、Sec13/Sec31复合物、Sec16等 COPII小泡装配时，也需Sar1的G蛋白参与。Sar1同GTP结合后，诱导COPII蛋白不同亚基结合并与ER结合，组装成一个完整的小泡。,COP II衣被小泡的组装,COPI和COPII衣被小泡,四、小泡的定向运输、停靠与融合机制,选择性和非选择性运输小泡，对运输方向都具高度选择性，能准确到达目的地，说明：所有的运输小泡的膜上可能都有某种标志，指示着它们沿一定方向前进，最终准确到达目的地。 那么定向运输和停泊的标志是什么呢？到达目的地后又是如何停泊的呢？ 又是如何突破膜结构障碍释放出内含物的呢?,Rothman等发现，动物细胞融合需一种可溶性细胞质蛋白：N-乙基马来酰亚胺敏感蛋白(N-ethlmaleimide-sensitive fusion protein, NSF)，及其它几种可溶性NSF附着蛋白(soluble NSF attachment protein, SNAP). NSF/SNAP能够介导不同类型的小泡融合，说明它们没有特异性,(一)运输小泡寻靶：SNARE假说 Rothman等提出了SNARE假说：膜融合的特异性是由其它蛋白所提供，他把这种蛋白称为SNAP受体(SNAP receptor)，或称SNARE，这种蛋白可以作为膜融合时SNAP的附着点。,SNAREs作用是保证特异性识别，并介导运输小泡与靶膜融合，动物细胞发现20多种SNARE，分布于特定膜上，运输小泡上的叫v-SNARE，靶膜上的叫t-SNARE。 v-SNARE和 t-SNARE都有1个螺旋结构域，能相互缠绕形成跨SNARE复合体，将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，使运输小泡特异性停泊和融合 含SNARE的脂质体和含匹配SNARE的脂质体间可融合，但速度很慢，说明除SN