实验四RNA的提取及其组分的鉴定.pptVIP

酵母核糖核酸的分离 及组分鉴定,学习从酵母中提取RNA和鉴定RNA组分的方法。,一、实验目的,二、原理：,核酸（nucleic acid),核苷酸(nucleotide),磷酸(phosphate),核糖(ribose),嘌呤（嘧啶）碱 Purine (pyrimidine) base,核苷(nucleoside),RNA(ribonucleic acid)背景知识,细胞RNA通常都是单链分子（但病毒RNA双链、环状、线型等多种形式），由核糖、碱基（A、U、G、C）和磷酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的RNA不断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白质合成的RNA有三类：转移RNA（transfer RNA）、核糖体RNA（ribosomal）和信使RNA（messenger RNA）。 研究表明，RNA不仅仅是遗传信息的中间传递体（from DNA to protein）。RNA的功能总结起来可以分为以下几类：控制蛋白质的合成；作用于RNA转录后加工与修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细胞持家功能；遗传信息的加工与进化。,RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。,酵母核酸中RNA含量较多RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的粗制品。,RNA的分离,RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸，可分别进行鉴定。,组分鉴定,核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸,核苷酸,三、材料与试剂,1、酵母 2、0.04mol/L的NaOH溶液 3、酸性乙醇溶液 0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中 4、95乙醇溶液 5、乙醚 6、1.5mol/L硫酸溶液 7、浓氨水 8、0.1mol/L硝酸银溶液 9、三氯化铁浓盐酸溶液 2mL10三氯化铁加入到400mL浓盐酸中,10、苔黑酚乙醇溶液 6g苔黑酚溶于100mL95乙醇（4保存） 11、定磷试剂 （）17的硫酸溶液 （）2.5钼酸氨溶液 （）10抗坏血酸溶液 （）蒸馏水 使用时按下比例临时配置（体积比）： 17的硫酸溶液: 2.5钼酸氨溶液:10抗坏血酸溶液:蒸馏水1 : 1 : 1 : 2,四、实验步骤,、酵母RNA的提取：,取酵母1.0g（3片）、 0.04MNaOH+8ml,研磨匀浆,沸水浴20min,离心10min（3000r /min）,冷却至室温,收集上清液于离心管 离心管中,加入7mL酸性乙醇沉淀RNA,离心3min（3000r /min）,收集沉淀,95%乙醇洗沉淀一次，,无水乙醇洗沉淀一次,离心3min（3000r /min）,沉淀即为RNA粗品,离心3min（3000r /min）,2、RNA组分的鉴定,RNA的水解：,用10m1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。,RNA组分的鉴定：,（）嘌呤碱 取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物 的絮状沉淀。 （）核糖 取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯化铁盐酸溶液，沸水浴10min， 观察颜色变化（亮绿色） （）磷酸 取0.2ml水解液+0.8ml水 +1ml定磷试剂 ，沸水浴10min ，观察颜色变 化（蓝色）,五 思考题 、如何得到高产量的RNA粗品？ 、本实验RNA组分是什么？怎样验证？,无水乙醇洗沉淀一次,离心3min（3000r /min）,沉淀即为RNA粗品,用10ml 1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。,（）核糖 取0.5ml水解液+0.2ml苔黑