部分临床药物的拉曼光谱研究

3部分临床药物的拉曼光谱研究摘要 本文利用拉曼光谱技术对抗生素、抗组织胺、血凝酶和止吐剂等几类常用药物进行了光谱测量，精确确定了其拉曼位移、拉曼峰的强度、包络的线形和谱线线宽等光谱特性，尝试以此为基础建立快速识别检测机制. 研究报告表明:小分子药物的光谱特征很明显，对其进行光谱识别简单易行;大分子都表现出较弱的光谱特征峰, 不仅导致了对其光谱识别的困难,也很难准确确定其位置. 对于不同药物，本文不但提出了用拉曼光谱测量和分析其药物成分的可行性，还通过分析其拉曼光谱的特性，为识别和分析其成分提供了实验证据. 本文不仅为建立药物的拉曼光谱数据库奠定了基础.还使业界看到了快速的识别和检测药物的前景. 关键词：拉曼光谱；抗生素；止吐剂；光谱分析Study on Raman Spectra of Some clinical medicineAbstractThe spectroscopic observations of several kinds of medicine, such as antibiotics, antihistamine, hemocoagulase and antiemetics, are carried out with the technique of Raman spectroscopy. The spectral properties are reflected by Raman shift as well as intensity, lineshape and linewidth of Raman envelope. The results show that drugs with small molecule have apparent spectral characteristics, by which to recognize them is very feasible, while those with large molecule have weak peaks in their spectra, leading to a difficult recognition as well as uncertain peak positions. This work not only proposes to identify chemical ingredients of drugs by observing and analyzing their Raman spectra, but also provides experimental evidences for doing so. The present results lay the foundation for establish the database of Raman spectra for drugs, and point out the prospect for rapid identification and detection of drugs.Key Words: Raman spectroscopy；Antibiotics； Antiemetics；Spectral analysis目 录第1章 绪论3 1.1拉曼光谱介绍 3 1.2 拉曼光谱特点3 1.3选题依据3 1.4本论文所做的主要工作4第2章 实验原理以及装置5 2.1 实验装置及原理5 2.2 实验方法6 2.3 样品制备6 第3章 测量结果分析与讨论83.1 抗生素类药物8 3.1.1 地西泮介绍及光谱分析8 3.1.2 奥硝唑介绍及光谱分析9 3.1.3其他药物光谱分析93.2 止吐剂药物11 3.2.1药物介绍11 3.2.2光谱分析123.3 特殊功能药物13 3.3.1药物介绍13 3.3.2光谱分析14第4章 存在的问题及讨论 16第5章 结论与展望17参考文献18谢辞18 20天津理工大学第1章 绪论1.1 拉曼光谱介绍光的散射分为弹性散射、非弹性散射，其中非弹性散射分为布里渊散射、拉曼散射；它们的入射光的传播方向和能量大小都发生改变. 而且布里渊散射的散射光频率和入射光频率差别很小，后拉曼散射中频率差别却很大. 由于水分子的拉曼散射效果非常非常弱，所以常将拉曼光谱法用于测试水溶液的体系中. 这就为拉曼光谱广泛运用于各个检测领域铺平了道路.1.2 拉曼光谱特点拉曼光谱主要具有以下特点：(1)每种样品都有独特的特征拉曼光谱，能够用来表现物质分子的精细结构1； (2)拉曼散射在入射光消失后的s内消失1可以说其具有瞬间性；(3) 物质的拉曼位移用波数来表示，单位1；(4)拉曼散射谱线普遍较窄，斯托克斯线与反斯托克斯线基本成对出现在瑞利线两侧1；(5)拉曼光谱运用于检测行业具有无损、廉价、快捷和操作简易等优势； 通过被测物质对光的散射，拉曼光谱可探测到其分子振动的信息，以便识别其振动模式是基于化学键的延伸还是弯曲. 虽然拉曼散射的强度通常很弱，但它即可对样品进行无接触、无损伤的测量，又具有分析速度快1，对极性基团灵敏2，不受水分子干扰3等优点而成为人们青睐的分析物质的成分和结构的重要方法4. 1.3 选题依据尽管目前对药物和食品的检测有多种光谱方法，如：色谱法5和红外光谱法5 等，但它们都有检测成本高、不适合水溶液样品等缺点，需要特殊的专业人才和昂贵的专业设备才能检测，显然不能推广市场化，而本课题希望以一种简单的方式和较为廉价的设备对样品进行拉曼光谱测量，为将拉曼法测量样品运用于民用领域铺平道路. 本课题组之前曾采用拉曼光谱技术对碳系、油类材料进行过研究，所以可以较容易将其拓展到一些研究较少的材料上，如：处方药物等，拉曼光谱发展多年来，还没有某家单位将临床药物大量系统地测量其拉曼光谱，而且，药物在如今与我们人类健康息息相关，假药也充斥在市场上，过去的一些检测方法都过于老套，耗时耗力，将现代先进的科学技术运用于生产和生活中的需求应运而生. 为此，本文对抗生素、止吐剂、血凝酶等常用十几种处方药进行了拉曼光谱的测量和分析. 通过分类和比较其共性和异性，不但能获得其光谱信息，还为运用该技术检测处方药奠定了基础. 1.4本论文所做的主要工作本文利用拉曼光谱技术对抗生素、抗组织胺、血凝酶和止吐剂等几类常用药物进行了光谱测量，精确确定了其拉曼位移、拉曼峰的强度、包络的线形和谱线线宽等光谱特性. 尝试建立一套识别这些药物的特征数据，验证拉曼光谱技术在常用药物检测方面究竟可不可以，存在哪些困难和不足. 提出和探究用拉曼光谱测量和分析其药物成分的可行性，还通过分析其拉曼光谱的特性，为识别和分析其成分提供了实验证据. 不仅为建立药物的拉曼光谱数据库奠定了基础.还使业界看到了快速的识别和检测药物的前景. 第2章 实验原理以及装置2.1实验装置及原理本实验装置为半导体激光拉曼光谱仪，有整装也有自制的部分，半导体激光器的输出波长为532.8 nm，扫描工作波段为300800 nm. 工作原理图如2.1所示. 图2.1 仪器工作原理图Fig.2.1 Instrument working principle diagram该仪器整体造价低廉，几万元，非常适合推广在民用商业领域并实现拉曼光谱检测的产业化链条.在测量过程中，考虑到瑞利散射的信号强度远大于拉曼散射信号（前者为后者的）的情况，本实验中则采用一个凹陷滤波器来降低瑞利峰的强度，使拉曼散射峰的相对强度增强，以便尽可能观察细微的拉曼特征峰. 这个凹陷滤波器造价几万元，并不是必须的，可以选择性添加使用. 实验中，我们需对凹陷滤波器的角度进行精细调节，通过反复优化使达到最佳效果. 旋转方位角并使基准线处于水平方向；然后调控张角，使在30-50之间反复优化，直至找到能使瑞利散最弱、拉曼散射最强的一个位置. 该步骤是本实验操作上的复杂和难点之处. 测量出的光谱中有若干拉曼峰，我们选择出最显著的几个特征峰，记录其强度，位置，频移等信息，作为识别这种药物的特征光谱信息，当特征数量不足或不明显时，光谱的包络位置、线型和延伸长度也可以作为参考.综合全部信息，尽可能准确地检别样品. 2.2 实验方法(1) 在正式测量前, 进行波长修正、基线漂移校正和光路调节. 测定暗箱中光度噪声后再调节光路. (2) 在532.8 nm处进行定点测量, 确保光路对正后，移动凹陷滤波器、使波峰达到最小值. (3)正式测量, 设置参数：间隔设置为0. 1 nm, 起始波长300. 0 nm, 终止波长800. 0 nm，阈值80，高压900V，积分时间100ms. （4）每次扫描时间大约在3-5分钟，为了避免环境等影响，通常来回扫描2次2.3 样品制备本实验所采用的被测样本主要为用于肿瘤临床诊疗的成品针剂. 包括：地西泮、奥硝唑、硫酸庆大霉素、地塞米松磷酸钠、哌拉西林钠-舒巴坦钠、哌拉西林钠-舒巴坦钠、盐酸异丙嗪、盐酸托烷司琼、盐酸甲氧氯普胺、盐酸昂丹司琼、盐酸氨溴索、低分子肝素钠、盐酸多巴胺、盐酸利多卡因和血凝酶共计15种样品，根据其结构和药性分成3组：（1）抗生素类：主要起杀菌和消炎作用. （2）止吐剂：主要起止咳、排痰和镇吐作用. （3）特殊功能药物：其功效不尽相同. 部分样品展示于图2.2. 图2.2 用于实验的部分样品Fig.2.2 Some samples used in the experiment通常，上述药物都密封冷藏于4摄氏度冰箱中，测量时用蒸馏水将其稀释至1mg/ml，现配现用，确保实验结果的准确可靠. 由于拉曼光谱是很敏感的，所以不需要太多样品，几毫克，几毫升即可，一个样品药剂甚至可以使用近百次，所以在特别昂贵的药品检测上，拉曼光谱法非常具有优势. 需要注意的是，部分药品只有存在于盐酸或者氯化钠水溶液中，特定的环境下才不会分解和氧化，而盐酸、氯化钠在溶液中，它们都是离子状态存在，并不会对我们的光谱产生影响. 可以放心使用其作为稳定剂. 第3章 测量结果分析与讨论本章对上述三类药物，共计15种样品，进行了拉曼光谱测量，并按照类别进行了举例和比较. 以下为所测量的样本的基本信息，包括名称、药理作用、光谱图、光谱特征以及相应的讨论. 3.1 抗生素类药物3.1.1 地西泮介绍及光谱分析 地西泮属于苯二氮卓类的抗焦虑药6，在临床上应用广泛. 为此,本文首先对地西泮进行了拉曼光谱的测量,其结果见图2.3 图3.1 地西泮拉曼光谱图Fig 2.3 The Raman spectrum of Diazepam由图3.1可见，在532.8nm处的瑞利峰右侧存在4个较为明显的拉曼散射峰，其波长相对532.8nm分别移动了12.5nm、25nm、44.5nm和 98nm，对应的拉曼频移分别为：430、841、 1446 和 2914. 另一方面，这4个拉曼散射峰的强度都很弱，它们与瑞利峰的强度比分别为0.0026、0.0027、0.0021和0.0012，这表明：地西泮的拉曼活性是很低的. 为了，凸现拉曼散射峰，故意在图3.1中不展示瑞利峰的顶端. 3.1.2 奥硝唑光谱分析本文对奥硝唑采用了两种测量方式，即使用和没有使用凹形滤波器，光谱图共同展示于图2.4 图3.2 奥硝唑拉曼光谱图 （A）通过与（B）未通过滤波器Fig 3.2 Raman spectra of Dexamethasone (A)with and (B)without notch filter从图中我们可以看出：当使用滤波器衰减瑞利峰时，瑞利峰确实明显衰弱了，但难免会使其它拉曼峰也被衰减，从而导致它们被部分地掩盖，未使用凹形滤波器虽然瑞利峰很高，但其它拉曼峰比较清晰. 为此，在图3.2中也展示了不用滤波器时的测量结果. 显然从图3.2中可以看出，当采用凹陷滤波器时，尽管部分散射峰被掩盖了，但仍能看清拉曼包络的位置和宽度等光谱特征来作为识别和鉴定药物的基础. 3.1.3其他药物光谱分析我们以瑞利散射峰的位置作为拉曼频移零点，测量出其它药物的拉曼光谱，并绘制出其余四种药物的拉曼频移光谱图3.3. 该测量过程未加凹陷滤波器. 图3.3 抗生素药物拉曼频移光谱图 (A)硫酸庆大霉素; (B)地塞米松磷酸钠(C)哌拉西林钠-他唑巴坦钠; (D)哌拉西林钠-舒巴坦钠Fig 3.3 Raman spectra of the antibiotics（A）Ornidazole；(B)Dexamethasone；(C)Piperacillin Sodium and Tazobactam Sodium；(D)Piperacillin Sodium and Sulbactam Sodium从图3.3可以看出，这四种药物的谱线虽然相似，但它们在低频区的差异相对显著. 由于这些差异主要由相同发色基团旁的不同助色基团导致，所以可以通过各个拉曼峰频移的大小来识别和区分它们，而在低频区域很多药物都有一个延伸1000左右的包络，初步怀疑为这些药物共有的苯环结构导致的，只不过因为周围拓展的不同基团而产生差异. 本实验利用上述方法测量了多种抗生素药物的光谱数据，表3.4列出了部分实验结果. 表3.4 常用抗生素药物的实验光谱数据Table 3.4 The experimental data of the popular antibiotics名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2地西泮4300.26地塞米松磷酸钠-107800.488410.27-89390.4214460.21-68140.3929140.12-33130.52奥硝唑-107800.46哌拉西林钠他唑巴坦钠-108240.42-68140.35-38120.62-33130.48-20280.50硫酸庆大霉素-104800.14哌拉西林钠舒巴坦钠-108240.20-68140.09-34600.27-32890.10由表3.4可见，总能找到部分药物之间的差异. 如:虽然奥硝唑和硫酸庆大霉素的3组特征峰的位置很接近，但其相对强度却是完全不同的. 换言之，即使在它们的拉曼频移相近时，上述的光谱特性仍可作为识别不同药物的依据. . 3.2 止吐剂药物3.2.1药物介绍1 盐酸异丙嗪抗组胺所致之毛细血管扩张，并降低其通透性. 适用于各种过敏症、某些麻醉和手术后呕吐，乘车、乘船引起的眩晕等. 2 盐酸托烷司琼为一种外周神经原及中枢神经系统5-羟色胺3（5-HT3）受体的强效、高选择性竞争拮抗剂，强力止吐药. 3 盐酸甲氧氯普胺 为一种镇吐药，可用于胃胀气性恶心、呕吐症状的对症治疗4 盐酸昂丹司琼属于一种强效、高选择性的5-HT3受体拮抗剂，有强镇吐作用. 抑制放射性化疗呕吐和预防、治疗手术后的呕吐十分有效. 5 盐酸氨溴索促进呼吸道内部分泌物的清理，同时能够减少粘液的附着，因而促进排痰. 适用排痰功能不良的呼吸系统疾病. 它们的分子结构图展示于图3.5图3.5 止吐剂药物结构图Fig 3.5 The structures of antiemetics可以看出，该类药物结构特点是都具有许多苯环，并在周围拓展了大量C-H 、C-C和C-N键的基团.3.2.2光谱分析采用同样的方法分析盐酸异丙嗪、盐酸托烷司琼、盐酸甲氧氯普胺、盐酸昂丹司琼和盐酸氨溴索这5种药物，光谱特征数据展示于表3.6 表3.6 止吐剂药物的光谱数据Table 3.6 The spectral data of antiemetics名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2盐酸异丙嗪-105642.73盐酸昂丹司琼-108240.08-89392.15-68140.07-30722.0625020.07盐酸托烷司琼-85980.14盐酸氨溴索-108240.2131000.12-36100.35盐酸甲氧氯普胺片-90550.09-18990.25-4510.0814160.07 从表3.6 数据中看出，止吐剂药物特征拉曼峰分布非常广，如盐酸甲氧氯普胺的拉曼频移，大到9055,小到451. 调查得知，在低能区峰是对应C-C骨架的摇摆、伸缩和振动，在高能区则对应C-H键的伸缩和振动8. 而14001300波段为CH2变形，C-O-H弯曲和C-C伸缩振动的混合出现区. CH键常体现在1350-650的低能区，该区被称为指纹区，所有有机化合物在此波段都有吸收带出现，而且分子结构的细微变化都能在此表现的十分灵敏，但该区光谱较少有特征性9，所以在前三种药物加装滤波器后检测，以线型来大致作为特征，发现他们都具有两个包络，一个延伸50nm,一个延伸100nm，而且位置极为相近，必然为他们具有非常相似的主链和助色基团导致. 3.3 特殊功能药物3.3.1药物介绍1 低分子肝素钠：低分子肝素钠结构非常复杂，具有良好的抗血栓作用.2 盐酸多巴胺多巴胺是去甲肾上腺素生物合成的前体，中枢性递质之一. 3 盐酸利多卡因为酰胺类局麻药. 作为局麻药主要用于浸润麻醉、硬膜外麻醉、表面麻醉及神经传导阻滞. 作为抗心律失常药可用于急性心肌梗塞后室性早搏和室性心动过速. .4 顺铂（冻干型）治疗癌症的常用药物，虽然副作用很强但抗癌谱广、疗效显著. 5 尖吻蝮蛇血凝酶酶性止血剂，是一种结构复杂的蛋白质，各种出血症的辅助治疗都可使用. 3.3.2光谱分析对低分子肝素钠、盐酸多巴胺、盐酸利多卡因、顺铂（冻干型）和尖吻蝮蛇血凝酶进行测量分析，首先比较该5种药物的光谱特征，列于表3.7表3.7 特殊功能药物的光谱数据Table 3.7 The spectral data summary of special function drugs名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2名称拉曼频移/cm-1相对强度*10-2肝素钠-98100.19注射用顺铂-108240.4713700.12-89390.4330260.11-68140.44盐酸多巴胺-108240.69-33130.5722330.53尖吻蝮蛇血凝酶-108240.4425020.566-89390.40盐酸利多卡因-108240.94-68140.36-89391.16-33130.46-34111.11 可以看出，这些药物的拉曼频移多处于300010000的范围内，其主要与药物分子主链端复杂的构成有关，如O-S双键、C-O键和磷酸基团等，其中28003000为C-H伸缩振动，32003000为N-H伸缩振动. 其次，尖吻蝮蛇血凝酶是从中国尖吻蝮蛇属毒蛇液中分离得到的酶性止血剂，为天然蛋白质，结构非常复杂，分子量在几万以上，多个肽链以不同的构型组合而成. 从数据对比中可以看到，顺铂和血凝酶这两种大分子药物在特征峰位置上十分相似，当仪器分辨率有限时，其具有的诸多发色基团以及侧链的不同构象，对振动峰位置产生复杂影响，使得区分比较困难. 如：血凝酶作为一种蛋白质，其含有的二硫键，有三种构象，各种多构象键互相交杂影响，导致拉曼活性低的样品光谱中出现无法寻找特征峰的包络. 最终无法准确识别药物. 最后，我们再多考虑药物之间的包络线型，尝试至少能辨别出二者为不同的药物. 各种药物线型数据展示于表3.8 表3.8 部分药物的光谱数据Table 3.8 The spectral data of some drugs名称包络位置/nm名称包络位置/nm奥硝唑333-369肝素钠334-369硫酸庆大霉素336-369613-713地塞米松磷酸钠333-368注射用顺铂340-369616-711618-713哌拉西林钠他唑巴坦钠333-369尖吻蝮蛇血凝酶333-368618-708616-711盐酸甲氧氯普胺333-370606-706虽然部分药物的拉曼峰数据差异小，但它们在包络数量，延伸长度上还是有微弱不同的. 如对顺铂和血凝酶两种药，拉曼峰位置没有差异，但包络位置有5nm左右的区别，在相对强度也有3*10-4的不同，虽然不能准确判断为何种药物，但至少可以判断出所测样本为不同的两种药物. 整个样本的测量后发现，相比较生活中的一些其他样品如：食物、饮料等等，药物的相对强度特别低，有些甚至低到与噪声混杂的地步，这样的样品我们只能归结为拉曼活性过低，可以尝试红外光谱等方法来测量. 红外光谱法与拉曼光谱法是相辅相成，互为补充的检测方法.第4章 存在的问题及讨论在实验中，存在较多时候拉曼光谱特征不明显的情况，主要是由于样本拉曼活性较低，针对拉曼活性低的样本，目前常采用表面增强拉曼光谱技术（SERS）来提高样本拉曼信号， SERS技术的机理还有待商榷，但大部分研究表明，吸附在粗糙金属如银、金、铜等表面的样品分子1,10，其散射截面要比普通样品分子高倍，因此，表面增强拉曼谱的信号比常规拉曼谱强倍. 该技术常使用银胶或银镜作为SERS的基底1,11，确实可以辨别出更多的拉曼峰和谱线精细内容12. 我们没有尝试这种测量方法，原因如下：1、 该方法过程复杂，基底溶液需要现配而且不能重复，清洗繁琐，对操作人员的要求过高.2、 配置溶液等需要专业人才，还有专业机器，成本上不适合推广到民用领域.3、 该基底对于样品的使用会产生限制，如：仅用超纯水冲洗的银镜表面残留物会对样品增强拉曼谱产生微扰13. 使分辨率不高的民用仪器雪上加霜，而且我们测量的样本会与有还原性的物质反应. 所以我们没有采用该方法. 我们在测量的过程中发现，可能是因为噪声的原因，有的物质的拉曼峰在低频区斯托克斯线明显，而有的在高频区反斯托克斯线明显. 我们利用拉曼峰在瑞利峰两侧多对称分布的特性14，以瑞利峰为中心向两侧波段灵活寻找对称峰，最终确定拉曼位移，是操作上非常简便可取方法.第5章 结论与展望本文系统研究了15种临床药物的拉曼光谱特性. 本文不但分析和讨论了它们的拉曼频移和活性，还发现上述药物的拉曼频移普遍较大，但活性却普遍较低. 通过不同药物的拉曼光谱的对比，本文发现：部分样品在330nm370nm和610nm710nm范围内都存在一个很宽的包络，且具有类似的线形；不同药品的特征峰的数目和相对强度都具有明显的不同. 本文不仅提供了许多采用拉曼光谱技术检测药物的实验证据，还对已有的分析方法进行了有力的补充. 通过对临床药物的识别和检测，本文展现了拉曼光谱的快速、准确、简单和低成本等优越性和普适性. 上述研究结果不但能增强业界对采用拉曼光谱分析和检测药物的认识，还为建立临床药物的拉曼光谱数据库奠定了基础. 相信在未来，拉曼光谱技术会运用到各个领域，展现其快速、准确、简便和低成本等诸多优势. 是真正的将科学技术应用与人类生活之中. 本文发表在了光谱学与光谱分析刊物上，EI索引，通过这篇文章的撰写，我感受到了做科研的艰辛，从选题，开题，查找背景文献到实验数据采集，制定方案，再到处理数据绘图，写文章，翻译文章，而且有时还要去参加招聘会和找实习单位，步步都是艰辛的，但是又是充实的，我在整个过程中学习到了非常多的东西，对我这四年所学的东西如 光谱学，原子光谱和光电显示技术等知识是一个综合性的考核，终于在最后将心血凝成一篇文章，以发表科研文章的标准要求自己，最终得以发表，真的感谢导师和同实验室师姐师兄的指导和协助. 参考文献1康倩倩. 拉曼光谱法研究抗炎药、抗生素及其与DNA的相互作用D. 西南大学, 2012. DOI:10.7666/d.y2085474.2 Li Zhan-long, Zhou Mi, Zuo Jian, (李占龙,周密,左剑)Chinese Journal of Analytical Chemistry（分析化学） , 2007, 35(11): 1636-1638.3 K. Kim, N. H. Kima and H. K. Park, “Ag particle-based molecularsensing/recognition via surface-enhanced Raman spectroscopy,”Biosensors and Bioelectronics, vol. 22(6), 2007, pp. 1000-1005.4 I. Lewis, G. Howell and M. Edwards. Handbook of Raman spec-troscopy. Raton: Chem.Rubber Comp, 2001. 5 Liu Wen-Ying(刘文英). Chinese Journal of Analysis Laboratory（分析实验室), 2000, 19(2): 91-108.6李敢峰, 曲晓峰. 川芎嗪与其他药物联合应用治疗哮喘J. 北方药学, 2011, 08(4):24-24.7 Tian Guo