实验六目的基因的PCR扩增.ppt

实验六 目的基因的PCR扩增,一、实验目的,通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。,PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 是一种体外扩增特异DNA片段的技术。,二、实验原理,二、实验原理,PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性 （2）引物退火 （3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。,二、实验原理,1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双 链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2、退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基 配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分 双链DNA，即退火阶段。 3、延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单 链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。,5 3,3 5,高温变性 低温退火 中温延伸 不断循环,聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图,目的片段,模板,引物对,二、实验原理,上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。,二、实验原理,二、实验原理,二、实验原理,PCR：变性退火延伸,二、实验原理,PCR,二、实验原理,二、实验原理,二、实验原理,二、实验原理,三、实验仪器与试剂,1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移 液器、吸头、电泳设备等。 2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq 酶（5u/l）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂 糖、TAE电泳缓冲液、6上样缓冲 液、溴化乙啶染液、等。,四、实验步骤,1、PCR反应一般在200 ul的PCR薄壁管中进行。,3、按下述循环程序进行扩增 943分钟，1个循环 94 30秒，5630秒，721分钟，30个循环 72 延伸10 分钟 4保温 4、扩增结束后取10l扩增产物，利用1.2%琼脂糖 电泳检测DNA扩增情况,四、实验步骤,五、实验结果,六、PCR反应条件的优化,1、温度、循环参数： （1）变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 加热9095，30 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 30 ，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。,（2）复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 60，30 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。 一般情况下选择55 30，足以使引物与模板之间完全结合。,六、PCR反应条件的优化,六、PCR反应条件的优化,（3）延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 75 之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 75 。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。 延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 1。,（4）循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 理论上说20 25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 30次是比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。,六、PCR反应条件的优化,2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。,六、PCR反应条件的优化,3、引物： 0.2 1 M 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物 之间形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 引物设计原则： 总原则是提高扩增的效率和特异性,六、PCR反应条件的优化, 长度1530 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右。 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。,七、引物设计原则,七、引物设计原则, 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。 引物的 5 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。, 引物的 3 末端碱基：原则上要求引物的3末端与模板DNA一定要配对，另外 3末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。,七、引物设计原则,由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。 1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不 挪作它用。 2. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能 一次性使用。 3. 每加一种反应物，应换新的枪头。,八、注意事项,1、PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过 程中各起什么作用？ 2、为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温 度变化？ 3、用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需 注意哪些事项？,九、思考题,引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：1530bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 45-55%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间不应有互补链存在 3端一定要与模板严格配对 5端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：Primer 5，Oligo，DNAsis等 引物Tm：DNA分子一半为单链，另一半为双链时的温度称为该复合体的溶解温度Tm，与G+C含量有关,PCR引物设计 AKP CDS 5542038 引物1 5GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3 BamH1 CDS 5AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT . . . . CDS .CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3 引物2 Hind 3GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5,扩增条件的优化 优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间 优化Mg2+浓度 模板的纯度，优化模板浓度 优化dNTP的浓度 优化引物浓度 PCR仪：热盖、升降温速度、精度