生物化学复习总结

1、 探针的分类 根据化学组成，可以将探针分为DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探针。DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。 肽核苷酸（PNA）探针 PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺） 寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析2、 DNA纯化方法 如果样品中残留的盐和SDS的浓度过高：酒精/NaAc沉淀，70%酒精洗 如果样品中残留的RNA过多：RNA酶37C半小时，酚/氯仿去除RNA酶 如果样品中残留的蛋白质、酚过多：酚/氯仿去除3、 DNA浓度测定 紫外分光法：1 OD260 = 50 g / mL ds DNA（双链） = 40 g / mL ssDNA / RN（单链） 计算举例：15 L DNA原液稀释至3 ml (200倍), 测得OD260 = 0.237, 则DNA = 0.237 50 200 = 2370 g / mL = 2.4 g / L 点样法： 1 L浓度未知的样品和1 L已知浓度的标准品或上次实验结果不错的剩余DNA样品分别与9 L溴乙锭(10 mg / mL)混合，紫外灯下目测二者的浓度差别，据此调整样品浓度后，再点样观察，直至二者浓度基本一致。4、 高通量测序技术的应用 重头测序（de novo sequencing） 重测序（resequencing） 全转录组测序（whole transcriptome resequencing） 小分子RNA测序（small RNA sequencing） 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq） 5、 DNA检测应用 新药研发、个性化基因诊断、癌症诊疗、 产前诊断、司法鉴定、食品安全、农牧业研究、环境保护、国防与军事DNA双螺旋结构模型要点：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T; G C） 相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。6、 重组DNA技术基本原理及步骤 目的基因的获取 基因载体的选择与构建 目的基因与载体的拼接 重组DNA分子导入受体细胞 筛选并无性繁殖含重组分子的受体分子（转化子）7、作为克隆载体最基本的要求是：具有自主复制能力，否则目的基因就无法进行克隆；携带易于筛选的选择标记，用于筛选成功的重组DNA，淘汰未重组的空载体；载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖；使用安全。8、外源 DNA 导入宿主细胞 将外源 DNA 导入宿主细胞是分子克隆的关键步骤之一。其导入方式是多种多样的：外源 DNA 导入原核微生物细胞外源 DNA 通过转化、转染以及感染等方式被导入原核生物细胞。 、转化或转染 如果外源 DNA 以重组质粒载体形式存在，则可通过转化或转染方式导入原核细胞。无论转化或转染都需用氯化钙处理宿主细胞，使其变得易于吸收外源 DNA 的感受态细胞。、噬菌体的体外包装与感染 如果外源 DNA 被包装成噬菌体颗粒，则可通过噬菌体感染机制导入宿主细胞。体外包装是将重组 DNA 分子与噬菌体的头部、尾部以及有关包装蛋白混合，从而组装成完整具有感染力的噬菌体粒子。 基因枪(微粒子轰击法)：是一种在高压电极作用下，与微小金颗粒或钨粉结合的DNA，瞬间穿透细胞的细胞膜，进入靶细胞、组织和器官的基因转移方法。微粒子进入细胞后，DNA逐渐从粒子中释放出来，开始表达。DNA显微注射：脂质体转染法：非病毒载体中最具代表性的是阳离子脂质体(cationicliposome)，它具有可自然降解、无免疫原性等优点，已成为重要的体外基因转移介质。阳离子脂质体通常由一个单一的阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成。阳离子脂质体与DNA通过静电作用相结合，构成脂质体质粒复合体。脂质体质粒复合体通过脂质之间的相互作用，与靶细胞融合进入细胞内，分解并释放质粒DNA，最后DNA进入细胞核并在其中表达。病毒介导的基因转移:是以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒的遗传物质中，通过这种重组病毒去感染受体宿主细胞，使外源目的基因在宿主细胞内表达。病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70的治疗方案采用了病毒载体，包括反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒等。这些病毒载体有各自的特点，同时也存在各自的局限性。9、 重组体的筛选与鉴定 在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。 这通常有三种鉴定方法： 一是重组体表型特征的鉴定， 二是重组 DNA 分子结构特征的鉴定 三是外源基因表达产物的鉴定。10、 表达载体的构建基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。所谓表达载体（ expression vector ）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅可使外源基因扩增，还可使其表达。表达系统的要求与主要调控元件包括：启动子、核糖体的结合位点、转录终止信号和密码子偏爱性等。11、蛋白质的紫外吸收 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含共轭双键氨基酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。 大多数蛋白质含有这几种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法12、 蛋白质一级结构测定的步骤蛋白质的分离纯化 二硫键的拆分与保护 亚基分离 多种方法的部分水解 分离水解后得到的多肽 测序 重叠 二硫键位置的确定 13、 蛋白质间的相互作用力 蛋白质内部：肽键蛋白质间：非共价键、氢键、范德华力、疏水键、 离子键 14、同源异形结构域（Homeodomains，HD） 是一种编码60aa的序列，长180bp，它存在于很多控制果蝇早期发育基因中，在高等生物中也发现了相关基序。 HD的C-端区域和原核阻遏蛋白的HTH同源，但也有几点不同:（1）HD的C端由3个-螺旋构成，螺旋3结合于大沟，长17aa；而阻遏蛋白由5个-螺旋构成，螺旋3长仅9个 aa；（2）原核的HTH的以二聚体形式与DNA结合，靶序列是回文结构，而HD是以单体形式与DNA结合，靶序列不是回文结构；（3）HD N-端的臂位于小沟，而HTH螺旋1的末端与DNA的背面接触。15、蛋白质和配基的结合 甾类受体蛋白一般都具有3个不同的功能区：（1）N-端区是激活转录所需的区域，不 同受体之间此区的同一性仅小于15%；（2）DNA结合及转录活化区，同一性较高为94-42%；（3）C-端的激素结合和二聚体形成区，同一性为57-15%。16、 生物大分子相互作用研究方法 噬菌体展示 酵母双杂交技术 免疫共沉淀 染色质免疫沉淀技术 表面等离子共振 荧光共振能量转移 串联亲和纯化17、 酵母双杂交系统 典型的真核生长转录因子， 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 用途：1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。优点：1）蛋白-蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。2）大规模筛选3）操作简单，直观（可以用荧光做报告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板筛选等）缺点：1）它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2）假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3）在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。18、 盐析盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，其突出的优点是： 成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法19、 有机溶剂沉淀法 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V = V0 (S2S1)/(100S2) 式中：V = 需加入100浓度有机溶剂的体积 V0 = 原溶液体积 S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度 100是指加入的有机溶剂浓度为100，如所加入的有机溶剂的浓度为95，上式的(100S2) 项应改为 (95S2) 。20、 选择性变性沉淀法 利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。21、 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG ) 。在一定范围内，高分子量和浓度高的PEG沉淀的效率高。 优点： 操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 沉淀后有机聚合物容易去除。 22、 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Laboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10 -3，数字越大，可分离的分子量也就越大。 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为110之间比较稳定。在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小。聚丙烯酰胺凝胶不象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。23、 琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖。琼脂糖是由D半乳糖（D-galactose）和3,6脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。100 时的水溶液呈液态，45 以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，凝聚成束状的琼脂糖凝胶。常见的琼脂糖凝胶有Pharmacia Biotech的Sepharose（2B 6B）和Bio-Rad Laboratories的Bio-gel A等。pH49间稳定，室温下很稳定，超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶的吸附作用很小、机械强度和孔穴的稳定性很好，高盐浓度下，柱床体积一般不发生明显变化，洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范