生物信息的传递

生物信息的传递(上)从DNA到RNA基因表达：是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。转录(transcription)：以DNA为模板，按照碱基互补原则合成一条单链RNA，从而将DNA中的遗传信息转移到RNA中去的过程称为转录。编码链(coding strand)=有意义链模板链(template strand)=反义链不对称转录(asymmetric transcription)：转录仅发生在DNA的一条链上。启动子(promoter)：是DNA转录起始信号的一段序列，它能指导全酶与模板正确的结合，并活化酶使之具有起始特异性转录形式。终止子(terminator)：转录终止的信号，其作用是在DNA模板特异位置处终止RNA的合成。转录单位：DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。3.1 RNA的转录转录的基本过程都包括：模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。1、模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。2、转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。3、转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。4、RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。5、当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，这就是转录的终止。3.1.1 转录的基本过程RNA合成的基本特点：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯键3.RNA的碱基顺序由DNA的顺序决定4.仅以一条DNA链作为模板5.合成方向为536.合成中不需要引物3.1.2 转录机器的主要成分原核生物RNA聚合酶： 亚基 基因 相对分子量 亚基数 组分 功能 rpoA 3.6510 4 2 核心酶 核心酶组装， 启动子识别 rpoB 1.5110 5 1 核心酶 和 共同形成 RNA合成的活性中心 rpoC 1.5510 5 1 核心酶 ？ 1110 4 1 核心酶 未知 rpoD 7.010 4 1 因子 存在多种因子，用 于识别不同的启动子1、RNA聚合酶 大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个亚基、一个亚基、一个亚基和一个亚基组成，称为核心酶。加上一个亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65105。研究发现，由和亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，加入因子以后，RNA聚合酶全酶识别启动子序列的特异性总共提高了107倍。因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，转录的起始从化学过程来看是单个核苷酸与开链启动子-酶复合物相结合构成新生RNA的5端，再以磷酸二酯键的形式与第二个核苷酸相结合，起始的终止反映在因子的释放。过去认为二核苷酸的形成就是转录起始的终止，实际上，只有当新生RNA链达到6-9个核苷酸时才能形成稳定的酶-DNA-RNA三元复合物，才释放因子，转录进入延伸期。真核生物RNA聚合酶 真核生物中共有3类RNA聚合酶。真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5105。除了细胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物线粒体和叶绿体中还存在着不同的RNA聚合酶。线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，相对分子质量小于7104，是已知最小的RNA聚合酶之一，与T7噬菌体RNA聚合酶有同源性。叶绿体RNA聚合酶比较大，结构上与细菌中的聚合酶相似，由多个亚基组成，部分亚基由叶绿体基因组编码。线粒体和叶绿体RNA聚合酶活性不受-鹅膏覃碱所抑制。 常用的转录抑制剂及其作用： 抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌的全酶 与亚基结合，阻止起始 链霉溶菌素 细菌的核心酶 与亚基结合，阻止延长 放线菌素D 真核RNA聚合酶 与DNA结合，并阻止延长-鹅膏蕈碱 真核RNA聚合酶 与RNA聚合酶结合起始复合物的形成转录可被分为4个阶段，即启动子的选择、转录起始、RNA链的延伸和终止。原核生物中：启动子选择阶段包括RNA聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closed complex）。真核生物RNA聚合酶所形成的转录起始复合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物转录起始过程中至少还需要7种辅助因子参与一般情况下，该复合物可以进入两条不同的反应途径，一是合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物，即所谓的流产式起始；二是尽快释放亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并生成由核心酶、DNA和新生RNA所组成的转录延伸复合物。RNA聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位点。只有带因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作为模板，合成均一的产物。因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。真核生物RNA Pol II的转录起始复合物真核生物转录起始除RNA聚合酶外，至少还需要7种辅助因子参与，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。3.2 启动子与转录起始2、启动子与转录起始 启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与范本DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。 转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。 3.2.1 启动子区的基本结构转录单元(transcription unit)：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起点是指与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即5末端的序列称为上游(upstream)，而把其后面即3末端的序列称为下游(downstream)。在启动子区内有一个由5个核苷酸组成的共同序列，是RNA聚合酶的紧密结合点，现在称为Pribnow区(Pribnow box)，这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为-10区。绝大部分启动子都存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区。这两段共同序列是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。Pribnow区（Pribnow box）这个区的中央大约位于起点上游10bp处，所以又称为10区。TTGACA。这个区的中央大约位于起点上游35bp处，所以又称为35区。10位的TATA区和35位的TTGACA区是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与因子相互识别而具有很高的亲和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游2530 bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区（图3-7）。另外，在起始位点上游7078 bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中35 bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAAT box）。在7080区含有CCAAT序列（CAAT box），在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。3.2.2 启动子区的识别氢键互补学说：RNA聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受DNA序列影响，又受其构象影响这一事实。3.2.3 酶与启动子区的结合在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开链复合物。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。3.2.4 -10区和-35区的最佳间距在原核生物中，-35区与-10区之间的距离大约是1619bp，小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。在细菌中常见两种启动子突变，一种叫下降突变(down mutation)，如果把Pribnow区从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构基因的转录水平；另一类突变叫上升突变(up mutation)，即增加Pribnow区共同序列的同一性。3.2.5 增强子及其功能能强化转录起始的序列为增强子或强化子(enhancer)。增强子很可能通过影响染色质DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得RNA聚合酶更容易与范本DNA相结合，起始基因转录。增强子与启动子的区别：1.增强子对于启动子的位置不固定，而能有很大的变动；2.它能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。3.2.6 真核生物启动子对转录的影响习惯上，将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中发现了类似Pribnow区的Hogness区（Hogness box），这是位于转录起始点上游2530 bp处的共同序列TATAAA，也称为TATA区。另外，在起始位点上游7078 bp处还有另一段共同序列CCAAT，这是与原核生物中35 bp区相对应的序列，称为CAAT区（CAAT box）。在7080区含有CCAAT序列（CAAT box），在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。TATA区的主要作用是使转录精确地起始；CAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。转录实际上是RNA聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。转录的终止 RNA聚合酶起始基因转录后，它就会沿着范本53方向不停地移动，合成RNA链，直到碰上终止信号时才与模板DNA相脱离并释放新生RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，范本DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。3.4 终止和抗终止不依赖于因子的终止 终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，由这段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构。在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3端为寡聚U，这种结构特征的存在决定了转录的终止。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡式结构（至少6bp）和寡聚U序列（至少4个U）长度的增加，终止效率逐步提高。依赖于因子的终止 因子是一个相对分子质量为2.0105的六聚体蛋白，它能水解各种核苷酸三磷酸，实际上是一种NTP酶，它通过催化NTP的水解促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。3.4.3 抗终止抗转录终止主要有两种方式：1.破坏终止位点RNA的茎环结构2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止3.3 原核生物与真核生物mRNA的特征比较原核生物mRNA的特征 mRNA在大肠杆菌细胞内占总RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA则占80%以上）。原核生物中，mRNA的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在mRNA刚开始转录时就被引发了。一个原核细胞的mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。 3.3.1 原核生物mRNA的特征1.原核生物mRNA的半衰期短2.许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在3.原核生物mRNA的5端无帽子结构，3端没有或只有较短的poly(A)结构4.原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列（Shine Dalgarno sequence）的保守区，因为该序列与16S-rRNA 3端反向互补，所以被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起作用。只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA（monocistronic mRNA），把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）。多顺反子mRNA是一组相邻或相互重迭基因的转录产物，这样的一组基因可被称为一个操纵子（operon），是生物体内的重要遗传单位。如大肠杆菌乳糖操纵子转录成编码3条多肽的多顺反子mRNA，经过翻译生成半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶。真核生物mRNA的特征前体RNA 成熟mRNA “基因”的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！3.3.2 真核生物mRNA的特征1. 真核生物mRNA的5端存在“帽子”结构：pppApNpNp 。2. 绝大多数真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。帽子结构帽子被扣在了mRNA的5端，并可能在几个位置发生甲基化。mRNA5端加“G”的反应是由鸟苷酸转移酶完成的 。帽子甲基化作用帽子0：出现在所有真核生物中。 尿苷酸一7一甲基转移酶 在G的7N位甲基化帽子1：除单细胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。2一甲基一转移酶第2个碱基的2OH位置上（实际上在任何修饰反应进行前，它是转录物中原来的第1个碱基）帽子2：甲基基团可以添加到戴帽mRNA的第3碱基上。这个反应的底物是已经具有两个甲基基团的帽子mRNA。2一甲基一转移酶催化2OH位置上甲基化这种帽子通常低于戴帽群体总量的1015。二、mRNA的转录后修饰-帽子 1、 帽子的种类 帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp-（共有） 帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp-第一个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化 （A N6 位甲基化） 帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYm 第二个核苷酸的 2-O 位上产生甲基化（A、G、C、U）其中: 单细胞真核生物只有 Cap0 Cap1 是其余真核生物的主要帽子形式 Cap2 存在于某些真核生物中2、 帽子结构的生成 甲基供体都为S腺苷甲硫氨酸（SAM） RNA鸟苷酸转移酶-戴帽酶（capping enzyme）3、 帽子结构的功能 （1） 对翻译起识别作用-为核糖体识别RNA提供信号 Cap0 的全部都是识别的重要信号 Cap1,2 的甲基化能增进识别 （2） 增加mRNA 的稳定性，使5端免遭外切核酸酶的攻击 （3） 与某些RNA病毒的正链合成有关 （Cap1、 Cap2 ） 除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化m6A形式Poly A尾巴3、 poly(A) 的功能 （1） 可能与核质转运有关 （2） 与mRNA的寿命有关 （3） 与翻译有关 a、 缺失可抑制体外翻译的起始 b、 胚胎发育中，poly(A) 对其mRNA的翻译有影 响（非poly(A) 化的为储藏形式） c、对含 poly(A) 的mRNA 失去 poly(A) 可减弱其翻译（4） poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值 a、 也可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离 纯化mRNAb、 用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成 cDNA 若 干 基 本 概 念 基因表达的第一步 以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下 按A U，CG 配对的原则，合成RNA分子 模板单链 DNA的极性方向为3 5, 而非模板单链 DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3. 模板单链 DNA的极性方向为3 5, 而非模板单链 DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3.3.5 内含子的剪接、编辑及化学修饰一、概述 割裂基因（split gene）：指编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔开 内含子（intron）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因中与这些RNA序列相应的DNA序列 外显子（excon）： RNA拼接（RNA splicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程 拼接点： 5 拼接点或左拼接点（内含子上游） 3 拼接点或右拼接点（下游）3.5.1 RNA中的内含子真核生物mRNA前体的加工：1. 5端形成特殊的帽子结构2. 在3端切断并加上一个poly(A)的尾巴3. 通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)4. 链内部核酸的甲基化内含子的分类 中部核心结构（central core structure）:在有些内含子中，含有4个重复的保守序列，长度为10 20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用 由于并非所有的内含子都有中部核心结构，所以有了内含子的分类类（group ）:含有中部核心结构的细胞器基因 核基因类（group ）:不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内 核基因 类（group ）:具有 GUAG 特征的边界序列核基因mRNA前体 RNA基因的内元均位于 tRNA 的反密码环上3、拼接方式 方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成 方式二：自我拼接（两类内含子 、 ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应3.5.2 RNA的剪接RNA的剪接实质：就是要把断裂基因的内含子除去，连接外显子。剪切方式：mRNA前体的剪接；自我剪接；蛋白质剪接(tRNA)。剪接体(spliceosome)：各种参与剪接的成分形成的一个体系。Ribozyme：有酶活性的RNA。拼接机制（Splicing mehanism ) SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接, 形成拼接体( spliceosome)。Spliceosome 逐级组装， SnRNA（U1、U2、U5和U4U6）分步替代U1通过5，拼接点互补而结合 U2识别并结合分支点A U1和U2作用使内元的 5端和 3端带到 一起（U1与 3拼接点配对） U1、U2、mRNA与U4U5U6复合物形成一个完整的拼接体3.5.3 RNA的编辑和化学修饰RNA的编辑：是在mRNA水平上改变遗传信息的过程。种类：单碱基突变；尿苷酸的缺失和添加化学修饰：甲基化；硫代；二价键的饱和化；去氨基化；碱基的同分异构化；核苷酸的替代。习题1.真核生物的TATA盒是:A.转录的起始点 B.翻译的起始点 C.RNA聚合酶与DNA模板稳定结合处 D.DNA聚合酶的活性中心 E.DNA合成起始位点2.关于RNA的叙述,错误的是:A.主要有mRNA、tRNA、rRNA三大类 B.胞质中只有一种RNA，即mRNA C.最小的一种RNA是tRNA D.原核生物没有hnRNAE.原核生物没有snRNA3.真核细胞中mRNA的加工修饰不包括:A.在mRNA 3末端加poly A尾 B.mRNA的前体是核内hnRNAC.在mRNA 5端形成7甲基鸟苷酸帽子结构 D.除去非结构信息部分E.不同RNA片段之间的拼接4.绝大多数真核生物mRNA 5端有:A.帽式结构 B.poly A C.起始密码子 D.启动子 E.SD序列5. snRNA的功能是:BA.参与DNA复制 B.参与RNA剪接 C.激活RNA聚合酶 D.形成核糖体 E.是rRNA的前体6.核酶(ribozyme)的底物是:A.DNA B.RNA C.核糖体 D.细胞核膜 E.核蛋白7.反义核酸作用主要是:A.封闭DNA B.封闭RNA C.降解DNA D.降解RNAE.封闭核糖体8.转录与DNA复制过程的共同点是:A.需要DNA聚合酶 B.所用模板相同 C.所用原料相同D.所得产物相同 E.需要RNA聚合酶1.真核生物mRNA转录后的成熟步骤主要包括 5端形成特殊的帽子结构在3端切断并加上一个poly(A)的尾巴通过剪接除去转录来的IVS(非翻译区)链内部核酸的甲基化生物信息的传递(下)从mRNA到蛋白质4.1 遗传密码三联子1、mRNA与蛋白质之间的联络是经过遗传密码的破译来完成的4.1.1 三联子密码及其破译遗传密码(code)：mRNA中蕴藏遗传信息的碱基顺序称为遗传密码,密码是密码子的总和。密码子(codon)： mRNA中每个相邻的三个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子。阅读框(reading frame)：遗传密码是三个一读，称为阅读框。AUG：蛋氨酸(Met)或起始密码UAA、UAG、UGA：终止密码UAG琥珀型(amber)密码子UGA蛋白石(opal)密码子UAA赭石型(ochre)密码子三联体密码的破译：以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指点多肽的分解核糖体结合技术4.1.2 遗传密码的性质1.密码的简并性：简并(Degenracy)：由一种以上密码子编码同一种氨基酸的景象称为简并。同义密码子(Synonymous codons)：对应于同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。2.密码的普遍性与特殊性：普遍性：无论在体外还是体内，也无论是病毒、细菌、植物还是植物，遗传密码均适用。特殊性：线粒体密码子，其它例外(支原体、四膜虫)线粒体mRNA中的密码子：与胞浆中mRNA的密码子有三点不同(哺乳植物)：1.线粒体中UGA不代表终止密码子，而是编码Trp；2.由AUG和AUA二个密码子编码；3.AGA和AGG不是Arg的密码子，而是终止密码子，即UAA、UAG、AGA和AGG均为终止密码子。密码子与反密码子的互相作用：反密码子(anticodon)：指tRNA上能辨认一个mRNA密码子的地位，这个地位上的碱基与密码子的碱基是互补的。所谓“摆动假说”(Wobble hypothesis)：即密码的第一、第二碱基是必需严厉依照规范配对(A-U、G-C)，而第三碱基则可以有一定水平的摆动灵敏性。Wobble hypothesis：1.恣意一个密码子的前两位碱基都与tRNA anticodon中的相应碱基构成Watson-Crick碱基配对。2.反密码子第一位是A或C时，只能辨认一个密码子。当反密码子第一位是U或G时，能辨认两个密码子。当Inosine(I)作为反密码子第一位时，能辨认三个密码子。3.假如数个密码子同时编码一个氨基酸，但凡第一、二位碱基不相反的密码子都对应于各自的tRNA。4.依据上述规则，至多需求32种不同的tRNA才干翻译61个codons(密码子)。密码子反密码子配对摆动的准绳：反密码子5端 密码子3端G U or CC G onlyA U onlyU A or GI U，C or A遗传密码子的根本特点：1.每个密码子三联体(triplet)决议一种氨基酸；2.两种密码子之间无任何核苷酸或其它成分加以别离，即密码子无逗号；3.密码子具无方向性，从N端到C端；4.密码子有简并性；5.共有64个密码子，其中有1个起始密码子和3个终止密码子；6.密码子有通用性，即不管是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相反的。二、tRNAtRNA的二级构造(三叶草构造)1. 3端含CCA-OH序列2. TC环(TC loop)：7个碱基3.额定环(extro variable loop)：3-18个碱基4.反密码环(anticodon loop)：7个碱基5.二氢尿嘧啶环(dihydr-Uloop或D-loop)：8-12个碱基6.螺旋区：4-5个碱基4.2 tRNA4.2.1 tRNA的L形三级构造tRNA的三级构造次要由在二级构造中未配对碱基间构成氢键而引发的。在三叶草构造中的氢键被称为次级氢键，在三级构造中的就称为三级氢键。大局部恒定或半恒定核苷酸都参与三级氢键的构成。4.2.2 tRNA的功用在蛋白质生物分解进程中，tRNA次要起转运氨基酸的作用。tRNA上与多肽链分解有关的位点：1. 3端CCA上的氨基酸承受位点2. 辨认氨酰tRNA分解酶的位点3. 核糖体辨认位点4. 反密码子位点4.2.3 tRNA的品种起始tRNA；延伸tRNA；同工tRNA；校正tRNA。校正tRNA：分为无义渐变及错义渐变校正在蛋白质的构造基因中，一个核苷酸的改动能够使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA)，使蛋白质分解提早终止，分解无功用的或有意义的多肽，这种渐变就称为无义渐变。错义渐变：由于构造基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。4.2.4 氨酰 tRNA分解酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反响式如下：AA+tRNA+ATP AA-tRNA+AMP+PPi它实践上包括两步反响：第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物。AA+ATP+酶（E） E-AA-AMP+PPi第二步是氨酰基转移到tRNA 3 末端腺苷残基的2 或3-羟基上。E-AA-AMP+tRNA AA-tRNA+E+AMP4.3 核糖体4.3.3 核糖体的功用4.3.1 核糖体的构造由几十种蛋白质和几种rRNA组成。包括两个亚基，大亚基约为小亚基绝对分子质量的一倍。每个亚基包括一个次要的rRNA成分和许多不同功用的蛋白质分子。核糖体上有不止一个的活性中心，每一个这样的中心都由一组特殊的蛋白质构成。核糖体的根本功用依赖于其中的rRNA，核糖体蛋白质起着增强rRNA功用的作用。多聚核糖体(polyribosome)：在执行蛋白质分解功用时，单个核糖核蛋白体常常5-6个或更多个串联在一同，构成一个聚合体，称为多核蛋白体或多核糖体(polyribosome或polysome)。4.3.2 rRNArRNA的根本特点1. rRNA是单链RNA。2.G-C碱基对与A-U碱基对的总量不等。3.单股rRNA链可自行折叠，构成螺旋区和环区，一切螺旋区的碱基都是保守的。4.一切来源rRNA均能构成4个构造域(、和)，每个构造域均含许多茎(螺旋段)和环，它们经过无间隔碱基对的互相反响彼此接近。5.绝大少数的rRNA碱基的特异功用尚不清楚。rRNA1、5S rRNA: 含与tRNA和23S rRNA辨认序列2、16S rRNA：含与mRNA5端和 23SrRNA互补序列。3、23S rRNA ：存在一段能与tRNAMet序列互补的片段，5S rRNA互补序列。4、5.8S rRNA ：与tRNA作用的辨认序列，同5SrRNA。5、18S rRNA ：与16SrRNA同源。6、28S rRNA4.3.3 核糖体的功用核糖体必需包括至多5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或承受AA-tRNA部位（A位）、结合或承受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及构成肽键的部位（转肽酶中心）。核糖体小亚基担任对模板mRNA停止序列特异性辨认，如起始局部的辨认、密码子与反密码子的互相作用等，mRNA的结合位点也在此亚基上大亚基担任携带氨基酸及tRNA的功用，肽键的构成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，A位、P位、转肽酶中心等次要在大亚基上。4.4 蛋白质合成的生物学机制4.4.1 氨基酸的活化氨基酸必须在氨基酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸AA-tRNA。tRNA与相应氨基酸的结合是蛋白质合成中的关键步骤，因为只要tRNA携带了正确的氨基酸，多肽合成的准确性就相对有了保障。4.4.2 翻译的起始起始密码子和起始信号：1.mRNA上的起始密码子常为AUG，少数为GUG2.在mRNA起始密码子上游8-13个核苷酸的地方往往有一段富含嘌呤的序列，称为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它和16S rRNA 3端有一个互补的序列，它们互相识别，以保证起始的正确性。Eukaryotic ribosomes migrate from the 5 end of mRNA to the ribosome binding site, which includes an AUG initiation codon.翻译的起始 ：第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，再在SD序列的帮助下与mRNA模板结合。第二步，在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。原核生物的翻译的起始因子：IF-1 9.5kd 加强IF-2，IF-3的酶活IF-2 95kd-117kd 促使fMet-tRNAfMet选择性的结合在30S亚基上IF-3 20kd 促使30S亚基结合于mRNA起始部分，阻碍30S与50S亚基的结合真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5 端的“帽子” 参与形成翻译起始复合物。真核生物的翻译的起始因子： eIF2 3种亚基 形成三元起始复合体(eIF2,GTP,tRNA)eIF2-A 65kd Met-tRNAmet与40S亚基结合 eIF1 15kd 促使mRNA与40S亚基结合 eIF3 500kd 促使mRNA与40S亚基结合eIF4b 80kd 促使mRNA与40S亚基结合eIF4a 50kd 促使与mRNA，GTP结合eIF4c 19kd 促使两亚基结合 eIF5 150kd 释放eIF2，eIF3eIF4e(eIF4f的亚基) 与5端帽子结合4.4.3 肽链的延伸过程：后续AA-tRNA与核糖体结合 肽链的生成 移位延伸因子：EF-Tu，EF-Ts，EF-G(原核生物) EF-1,EF-2(真核生物) 2个GTP后续AA-tRNA与核糖体结合细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨基酰-tRNA的结合。该氨基酰-tRNA首先与EF-Tu GTP形成复合物，进入核糖体的A位，水解产生GDP并在EF-Ts的作用下释放GDP并使EF-Tu结合另一分子GTP，进入新一轮循环。肽键的生成核糖体mRNAAA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位。在肽基转移酶（peptidyl transferase）的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。移位肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA 3 端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA2从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。4.4.4 肽链的终止终止因子：原核生物有3种蛋白因子:RF1、RF2、RF3。RF1用于识别终止密码子UAA、UAG；RF2帮助识别UAA、UAG；RF3不识别终止密码子，主要是协助肽的释放。一旦tRNA从核糖体上脱落，则核糖体立即离开mRNA，并解离成50S和30S亚基，核糖体可以重复使用。真核生物仅一种：RF4.4.5 蛋白质前体的加工1.N端fMet或Met的切除2.二硫键的形成：蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化形成3.特定氨基酸的修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化、羧基化4.切除新生肽链中的非功能片段糖蛋白中常见的糖肽连接键：N糖苷键：-N-乙酰氨基葡萄糖基-天冬酰胺(GlcNAc-Asn)O糖苷键：-N-乙酰氨基半乳糖基-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)4.4.6 蛋白质合成的抑制剂1.抗生素类阻断剂：链霉素、卡那霉素、新霉素等：竞争性抑制蛋白质合成四环素和土霉素：四环素阻止氨酰-tRNA转移到A位置氯霉素：阻断50S亚基的活性嘌呤霉素(Puromycin)白喉霉素(diphtheria toxin)：与延长因子发生作用2.干扰素对病毒蛋白合成的抑制：从白细胞中得到-干扰素，从成纤维细胞中得到-干扰素，在免疫细胞中得到-干扰素。抗生素抑制蛋白质生物合成的原理抗生素 作用点 作用原理四环素族 原核核蛋白体小亚基 抑制氨酰- tRNA与小亚基结合氯霉素 原核核蛋白体大亚基 抑制转肽酶，阻断延长链霉素/卡那霉素 原核核蛋白体小亚基 改变构象引起读码错误， 抑制起始 嘌呤霉素 原、真核核蛋白体大亚基 抑制转肽酶，妨碍移位放线菌酮 真核核蛋白体大亚基 抑制转肽酶，阻断延长红霉素 原核核糖体大亚基 阻断移位，阻断Pro合成延长4.4.7 RNA分子在生物进化中的地位RNA在生命起源中的地位及其演化过程生命是自我复制的体系：三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。由RNA催化产生了蛋白质DNA代替了RNA的遗传信息功能DNA双链比RNA单链稳定；DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。4.5 蛋白质运转机制蛋白质运转类别若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。4.5.1 翻译运转同步机制信号序列(signal sequence)：在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列就被称为信号序列。信号肽(signal peptide)：绝大多数越膜蛋白的N端都具有长度大约在13-36个残基之间的以疏水氨基酸为主的N端信号序列或称信号肽。信号肽的结构特点：1.一般带有10-15个疏水氨基酸2.常常在靠近该序列N-端疏水氨基酸区上游带有1个或数个带正电荷的氨基酸3.在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链(Ala或Gly)信号序列的基本作用：1.通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合2.通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运SRP & DP信号识别颗粒(signal recognition partical，SRP)：是一种核糖核酸蛋白复合体，它的作用是识别信号序列，并将核糖体引导到内质网上。停靠蛋白(docking protein，DP，又称SRP受体蛋白)：即SRP在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合，使它在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。信号肽假说(signal hypothesis)：提出：G.Blobel & B.Dobborstein(1975)证明：基因重组实验核心内容：核糖体同内质网的结合受制于mRNA中特定的密码序列(可以翻译成信号肽)，具有这种密码序列的新生肽才能连同核糖体一起附着到内质网膜的特定部位。已知野生型细胞中，-半乳糖酶定位于胞质内，麦芽糖结合蛋白定位于胞外，麦芽糖运转蛋白位于外膜内腔。如果把-半乳糖酶羧基端基因片段与麦芽糖运转蛋白和麦芽糖结合蛋白的氨