土壤中淀粉酶菌株的筛选

土壤中高产淀粉酶菌株的筛选方案：一、实验材料样品:四川化工职业技术学院采集的土样若干试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱.移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等液体培养基:淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、硫酸0.5g、磷酸氢二钾1g、牛肉膏1g，定容1L二.实验步骤(一)培养基的配置1.称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。3.分装 将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。4加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染。5.包扎 加塞后，将全部试管和三角瓶用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。培养皿、移液管、涂布棒用报纸包扎好。试管里面加入45ml自来水，三角瓶里面加入90ml自来水和玻璃珠，加塞，包扎。6.灭菌 将上述培养基及其仪器1213，20分钟高压蒸汽灭菌。7.搁置斜面及倒平板 将灭菌的试管培养基冷至50左右（以防斜面上冷却水太多），将试管口一端搁置在书边上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。三角烧瓶里的培养基在超净工作台上倒平板，然后静止，待其凝固（二）产淀粉酶菌株的分离、纯化1.土样的采集（1）地点的选取：四川化工职业技术学院花园（潮湿）（2）采集时间:2013-9-58:00（3）采集原则：地点选取后，用小铲子出去5cm表土，取离地面5-20cm处的土，盛与袋中并标明时间，地点及环境情况。2.菌悬液的制备和梯度稀释（1）取10g土壤样品加入90ml无菌水中并放于震荡培养箱中培养20分钟,然后在水浴锅中放置30分钟，取出待冷却至室温。（2）取六只试管编号16分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到101106六个稀释度的菌悬液。3涂布平板法分离产淀粉酶细菌(1）倒平板：将配置好并已灭菌的淀粉培养基倒入培养皿中（大约10-15ml）(2)涂布：取0.2ml稀释度为103菌悬液倒入平皿，用涂布棒涂匀，标记后倒扣放入恒温培养箱37C恒温培养24小时。依次对104、105、106三稀释度的菌悬液进行上述操作。(3)培养24小时后取出培养皿，然后加入少量碘液，观察其透明圈的大小。4.平板划线法纯化菌株(1)将上述已分离好的产淀粉酶菌株划线纯化（挑取透明圈比较大的菌株）(2)重复上述操作2-3次，直至出现单菌落。（三）;鉴定选择单菌落进行制片,革兰氏染色观察其形态,保存单菌落。（四）.高活力淀粉酶菌株的筛选1、将斜面上保存的菌种活化后制成10-6菌悬液。2.配置液体培养基：取淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、硫酸亚铁0.5g、磷酸氢二钾1g、牛肉膏1g，加水溶解定容至1L。将培养基在1213，高压蒸汽灭菌20min。3、将制好的菌悬液按体积分数4的接种量接种于装有液体培养基的摇瓶中，编号，摇瓶容量250mL，装量50mL，培养温度37，摇床转速180r/min，培养24h。种子液做镜检观察。4、培养好的液体4000r/min离心20min,取上清液0.2mL与1mL质量分数1的淀粉溶液于37水浴5min，然后沸水浴5min，终止反应，再加入1ml碘液，沸水浴5min后，迅速冷却观察颜色。以空白液体培养基加质量分数1淀粉直接煮沸再加1ml碘液，反应后作为空白对照。（五）:实验预期结果：终止反应后观察到的颜色，如果颜色越淡则表示该菌株的产淀粉酶酶活较高，反之则比较底。在点样法中,得到的比值越大说明产淀粉酶活性越高,反之则比较低.。在观察颜色和测量直径是存在