现代生物技术在传统调味品产业中的应用

现代生物技术在传统调味品产业中的应用李习 姚继承（武汉佳成生物制品有限公司，武汉430063）摘要：本文从基因工程、细胞工程、酶工程及发酵工程四个方面，总结了现代生 物技术在酱油，食醋，酱制品等传统调味品产业中的应用现状，并对现代 生物技术在我国传统调味品产业中的研究前景进行了展望。关键词：现代生物技术 酱油 食醋 酱制品 我国是调味品生产大国，也是消费大国。人们日常生活中经常食用的调味品有酱油、食醋、酱制品、味精、腐乳、腌菜等，它们不仅具有基础调味，改善色香味的作用，还有一定的杀菌功能和保健功效。在我国产业化的传统调味品中主要部分是传统发酵调味品，是指农产品在微生物作用下分解而成的一类调味品，主要包括酱油、食醋、酱类、味精、酱腌菜、腐乳等。在多种微生物的作用下，把原料中的不溶性高分子物质分解为可溶性低分子化合物，产生一系列的生化反应。分解物的相互组合、多级转化和微生物的自溶形成了种类繁多的呈味、生香物质，构成了营养丰富、风味独特的传统发酵调味品。1. 现代生物技术与传统调味品的关系 生物技术也称生物工程，它包括传统生物技术和现代生物技术。传统生物技术主要包括自然发酵技术和自然杂交育种技术。现代生物技术是以基因工程为核心的新兴学科，它涵盖了基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等学科，是研究生物学、医学、农业与食品科学的基础工具1，传统调味品产业属于食品科学的范畴。随着现代生物技术的不断发展，它在传统调味品产业中的应用也越来越多，将会把传统调味品产业推动到一个新的高度。传统调味品在我国已有上千年的历史，主要有酱油、醋、酱制品、味精、腐乳、酱腌菜等，但一直都是以传统的方法进行酿造和生产，现代生物工程技术的应用决定着传统调味品产业的工业化生产道路。本文将主要从现代生物技术在酱油、食醋、酱制品三个传统调味品产业方面的应用进行讨论。2.现代生物技术在传统调味品产业中的应用2.1酱油产业2.1.1基因工程和细胞工程在酱油产业中的应用在酱油酿造中起主要作用的是米曲霉和酱油曲霉，利用基因工程对米曲霉的分子生物学进行研究后取得的进展可应用于提高酱油的质量。Galagan等（2005）对米曲霉的基因组进行研究，发现了与生物降解、转录调控、初级及次级代谢及细胞信号有关的基因2，这为选育米曲霉优良菌种提供了依据。基因工程技术还用于鉴定不同种类的米曲霉菌株，潘力等（2007）从不同来源的酱油曲中分离出6株米曲霉，并与沪酿3.042进行了随机扩增多态性DNA技术分析（RAPD），探讨6株米曲霉系统发育的亲缘关系，利用RAPD扩增图谱可以区分形态上难以分辨的不同米曲霉3。原生质体融合技术已在许多工业微生物的菌种改良上得到了广泛应用，选育出了许多性能优异的新菌株。徐德峰（2010）用原生质体融合技术将遗传特性不同的亲本 A. oryzae HN3042 和 A. niger CICC2377进行融合，设计恰当的筛选程序，经合理筛选后获得了具有双亲优良性状的稳定融合子F76。两亲本菌种是丝状真菌曲霉属中的食品级工业安全菌株（GRAS），A. oryzae HN3042被广泛应用于酱类的生产中，但是产酸性蛋白酶活力不足；A. niger CICC2377主要应用于柠檬酸发酵，其酶系中酸性蛋白酶和淀粉酶活力都较高，能在pH较低（4.55.0）的环境下充分降解蛋白质和淀粉质原料。融合子F76产酸性蛋白酶的活力比亲本菌株 A. oryzae HN3042 提高了82.19 %，传代稳定且酶系均衡，但还需要进一步的研究后才能应用到实际生产中4。2.1.2酶工程在酱油产业中的应用酱油的发酵过程离不开各种各样的酶，经过专家学者长期的探索研究和生产实践表明淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等酶制剂在酱油酿造中起着举足轻重的作用。无论是将工业酶制剂添加到酱油发酵过程中来强化补充酱油曲中的酶系不足，还是全部或部分替代酱油曲，都能明显提高原料的利用率。由施安辉等（2003）选育的黑曲1号菌株产高活性中性、酸性蛋白混合酶，乾氏曲霉78B2产高活性纤维素酶，将它们分别制固体曲并按比例混匀。该复合酶制剂的酶类组成和酶活性如下：中性蛋白酶7562u/g，酸性蛋白酶11520u/g，-淀粉酶12405u/g，纤维素酶91000u/g，糖化酶3860u/g，果胶酶241u/g，木聚糖酶1260u/g，植酸酶61u/g。在低固态工艺的基础上，利用半酶半曲法酶解酿造酱油，采用50 %的混合料制曲，50 %的混合料加复合酶，半酶法加复合酶的量以10 %为宜。中试结果表明：半酶半曲法节约了50 %制曲成本，同时产品的出品率每公斤混合料可多出三级酱油0.6kg5。随着酶制剂工业的发展、酿造复合酶的开发和应用技术的改良，酶制剂在酿造酱油生产中的应用将会更加普遍。2.1.3多菌种协同发酵在酱油产业中的应用 杨钦阶等（2011）以沪酿3.042米曲霉和黑曲霉AS3.4309混合制作大曲，采用固态低盐发酵酿造优质酱油，对影响酱油中总氮和氨基态氮含量的因素进行了优化，在最佳工艺条件下，酿造酱油的蛋白质利用率高达86.28%，氨基酸转化率高达55.64%6。在酱油生产中，姚继承等（2007）采用糖化增香曲及复合制曲技术，发挥多菌种制曲的优势，促进原料中蛋白质与淀粉的分解，使风味物质成分增多，酿造的酱油色香味俱全，质量优于普通酱油，原料全氮利用率和酱油出品率也得到明显提高7。豆粕和面粉是酱油酿造的主要原料，经发酵、抽酱油后会产生大量的废渣。经分析，酱油废渣的填充物较少，残存的营养成分远远高于醋渣。以酱油渣为基础培养基，利用假丝酵母与黑曲霉按1：1比例混合的菌株发酵后能生产出具有较高蛋白酶酶活的菌体饲料添加剂8，通过多菌种协同发酵使酱油废渣变废为宝。2.2食醋产业2.2.1基因工程和细胞工程在食醋产业中的应用在食醋酿造中，可以采用细胞融合技术、基因工程进行定向育种，选育出高性能的基因工程菌进行发酵来提高发酵效率和产品质量。还可以利用DNA分析技术，通过16S rDNA、18S rDNA 和染色体DNA分析对样品中的多种微生物进行分析，获取微生物群的动态变化情况及其主要微生物。Luciana等（2006）采用梯度凝胶电泳( DGGE) 技术测定传统香醋中的醋酸菌，DGGE是一种研究微生物多样性的常用方法，DGGE条带经测序后进行序列对比可得到同源性分析结果和系统发育树图，分析其结果可知传统香醋中的醋酸菌与其它已知菌种亲缘关系的远近9。食醋酿造过程中可以将酵母菌和醋酸菌固定在合适的载体上，Fumi等（1992）采用海藻酸钠固定醋酸菌，对固定化工艺进行优化后的实验结果表明：氧气消耗量、细胞释放速率和海藻酸钠凝胶浓度有关，不同浓度不影响细胞通过率，双层海藻酸钠凝胶层对细胞活力没有影响10。天津市调味品研究所和南开大学分子生物研究所也用海藻酸钠固定醋酸菌生产食醋并获得成功，细胞固定化发酵可提高发酵效率，缩短生产周期，并且菌体可重复利用，但是由于固定化菌种在重复使用时存在易染杂菌和贮存问题，还未能将此方法应用到工业生产中。2.2.2酶工程在食醋产业中的应用 食醋生产之后会产生大量的醋渣，醋渣的处理可以利用蛋白酶的催化性质来进行水解，与酸、碱法比较，酶法水解效率更高，而且处理后的醋渣蒸煮料的营养成分也比酸、碱法高出很多。可水解醋渣蒸煮料的酶类很多，不同类型的酶对醋渣蒸煮料的酶解能力不同，胰蛋白酶酶解所得的氨态氮转化率最高。梁峙（2000）选择了胰蛋白酶，胰蛋白酶加碱性蛋白酶，胰酶加中性蛋白酶，酸性蛋白酶四组进行试验，试验结果表明单酶效果最好的为酸性蛋白酶，它除了能提高氨态氮的转化率以外，反应条件也易于控制，不易生长杂菌；效果最好的复合酶为胰蛋白酶加中性蛋白酶，它结合了胰蛋白酶与中性蛋白酶的优点11。2.2.3多菌种协同发酵在食醋产业中的应用 由于液态发酵食醋中所含的有机酸、酯类、游离氨基酸等有机物的种类少而且含量低，因此酿造的食醋酸味不绵柔，香味成分不丰富。赵春燕等（2008）利用醋酸菌、乳酸菌和酵母菌的协同发酵，使酿造出的食醋酸味变的柔和，增加酯类含量使香味变得饱满12。林祖申（2005）在食醋酿造单一的黑曲霉(麸曲)中添加根霉、米曲霉或As 3.350黑曲霉，用15%豆粕经米曲霉酶解生产氨基酸，补充氨基酸含量在0.1%以上；在发酵中后期添加乳酸菌与酵母菌共酵，乳酸含量在0.9%以下，对酵母菌有一定的促进作用，共酵后的不挥发酸可提高415%，酯提高66.7%，达到改善食醋风味的目的13。2.3酱制品产业2.3.1基因工程和细胞工程在酱制品产业中的应用 变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种用于微生物突变位点检定和复杂细菌样品的多样性分析的分子标记方法，汪孟娟(2011)以酱制品中的豆豉为研究对象，结合传统活菌计数和DGGE技术，监测了其制曲和生产阶段参与发酵的微生物数量和种类的动态变化，并通过UPGMA相似性聚类分析构建了系统发育树，总结了各阶段菌系的差异14。这些研究结果为稳定传统豆豉发酵产品的质量和标准化生产提供了依据，也为有效防止杂菌对豆豉产品的污染奠定了基础。孟望霓等（2011）采用原生质体融合技术，使枯草芽孢杆菌B1与纳豆芽孢杆菌进行原生质体融合，获得了融合菌株RH3519，其纯种发酵豆豉的品质比原始菌株和自然发酵豆豉的高出很多。经生理生化鉴定表明，RH3519菌株属于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌，它的遗传稳定性很高，发酵不产气，可满足工业生产的要求15。2.3.2酶工程在酱制品产业中的应用 酶工程在酱制品产业中的应用也有很多，陈宇（2008）在甜面酱的发酵的液化阶段添加一定量的高温 -淀粉酶，并在前发酵期间加入黄酒酵母、酱油大曲、复合酶，通过添加各种酶系并对酿造工艺参数进行调整，获得在缩短生产周期的同时使产品的鲜、香味非常接近天然晒酱的甜面酱16。利用生物酶技术生产酱制品是可行的，并且适合机械化大生产。但是液化效果和液化效率受设备的制约较明显，通过对设备进行改造，提高液化液浓度，可有效地提高液化效率。传统发酵酱制品特有风味的形成与生产工艺、周围菌落环境和气候等因素有关，因此在日后的工艺研究过程中，应进一步深入研究酶工程对发酵过程的影响，进一步完善原有的工艺。2.3.3多菌种协同发酵在酱制品产业中的应用 多菌种协同发酵生产酱制品是酱制品发展的趋势，多菌种发酵使酶系更加丰富，但是多菌种发酵的制曲难度较大，各菌种之间的配比和添加量需要在生产过程中进行大量的研究和应用才能确定。刘素纯等（2004）利用米曲霉AS 3.042、黑曲霉AS 3.350、根霉Q303等多种菌种的协同作用，在温度先高后低的条件下，进行固态发酵，使产品与单一菌种发酵相比，酱香、酯香更加浓郁，鲜味明显提高，氨基酸氮含量提高了30.2%，全氮含量提高了11.2% 17。姚继承等（2007）基于多菌种复合制曲优于单一菌种的原理，研发出了发酵酱制品的糖化增香曲及复合制曲技术，多菌种发酵丰富了酶系，更利于产品呈味、呈色物质产生，使产品味鲜色美。由于酶系增加，应用于实际生产中缩短了发酵周期，提高了原料利用率，产品质量也得到显著的提高7。2.4其它传统调味品产业 在味精发酵产业中，筛选出耐高温的谷氨酸产生菌株是主要研究的课题之一，提高谷氨酸菌株的耐高温性能可大大降低生产过程中维持发酵温度所产生的成本。目前关于谷氨酸发酵关键技术的研究主要集中在利用代谢工程、代谢网络模型分析等技术手段来研究谷氨酸生产菌株的生理学特性，并利用分子生物技术对谷氨酸棒杆菌全基因组进行序列测定、比对分析的基础上选育出优良的生产菌种18。王燕等（2003）采用基因组改组技术选育出耐高温的谷氨酸生产菌株，首先通过温度和产酸特性的比较选出较优的原始出发菌，再采用传统诱变方法对原始出发菌进行原生质体诱变，筛选出优良特性菌株作为基因组改组的出发菌株，最后利用出发菌株多母本原生质体递近融合，在选择性平板上筛选出耐高温、高产谷氨酸的融合子19。获得的耐高温谷氨酸生产菌株对于味精产业的发展具有重大的意义。 现代生物技术在腐乳产业中也有广泛的应用，刘会勇等（2003）在腐乳发酵阶段调整温度后添加增香酵母和复合酶，添加的增香酵母加速了腐乳香气的形成并丰富了香味成分，添加复合酶并控制适合的作用温度，则能加速腐乳中各成份的分解促进腐乳风味物质的形成，从而达到了利用酶工程技术缩短腐乳发酵周期的目的20。多菌种协同发酵技术也被应用到腐乳产业中，张斌等（2011）分离纯化出产蛋白酶活力较高的鲁氏毛霉和米根霉，筛选所得毛霉根霉以73制成混合菌悬液，结果显示利用混合菌种发酵腐乳可以减少产品杂菌的污染，并能产生更加独特的风味，同时提高菌种发酵产率和底物利用率21。此研究有广阔的应用前景，将会促进腐乳产业的发展。3. 结论和展望 应用现代生物技术不断提升传统调味品产业，促进其快速步入新型工业化道路。现代生物技术有基因工程、细胞工程、酶工程及发酵工程等，要不断将新技术运用到传统调味品如酱油、食醋、酱制品生产体系中，其中应用最广泛的就是酶工程以及发酵工程。但是我国传统调味品无论在品种、数量还是质量上，都与国际先进水平存在着一定的差距。利用现代生物技术与传统工艺相结合，进行新技术的开发和研究是缩小这一差距的有效手段。武汉佳成生物制品有限公司针对传统酱油、食醋、酱制品产业生产了相应糖化增香曲，它以优质无污染的粮食原料，利用现代生物工程技术筛选纯化后的复合菌种发酵而成，是国内首创专业用于传统调味品酿造的复合菌种。利用现代生物技术进行调味品研发将是我国传统调味品产业的一大研究方向。参考文献1袁仲.现代生物技术在食品工业中的应用J.农产品加工,2005,3:64-66.2Kim J.-S., LEE Y.-S. A study of chemical characteristics of soy sauce and mixed soy sauce:chemical characteristics of soy sauce. European Food Research Technology J.2008,227: 933-944.3张艳芳.多菌株制曲促进酶系优化与提高酱油质量的研究D.无锡:江南大学学位论文,2009.4徐德峰.高活力酸性蛋白酶曲霉融合子的选育及其在酱油发酵中的初步应用D.广州:华南理工大学博士学位论文,2010.5施安辉,孙启法,贾鹏辉,等.半酶半曲法酶解酿造酱油新工艺的探讨J.中国调味品,2003(6):13-15.6杨钦阶,刘志伟,熊瑞权,等.多菌种混合发酵提高酱油品质的研究J.广东农业科学,2011:21.7姚继承,陶贵明,屈光伟,等.糖化增香曲在发酵酱油和酱制品中的应用探讨J.中国酿造,2007(3):61-65.8曹日亮,杨晋青,胡广英,等.利用生物技术开发酱油渣试验J.山西农业科学,2003,31,(3):84-86.9Luciana De Vero,Elisabetta Gala,Maria Gullo,et al.Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis to evaluate acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegarJ.Food Microbiology,2006,23( 8) : 809-813.10MD Fumi,A Silva,G Battistotti,et al. Li