《抗肿瘤药物筛选》PPT课件.ppt

抗肿瘤药物筛选,侯桂琴 郑州大学药学院,内容提要,一 细胞筛选 二 微生物学筛选方法 三 精原细胞法 四 利用分子靶点筛选 五 动物模型 六 基因芯片技术,一 细胞筛选,筛选方法 1.四氮唑蓝（MTT）还原法 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值,实验组光吸收值（A） 细胞存活率= 100% 对照组光吸收值（A） 可用细胞存活率对剂量作图求出IC50值,应用：生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 特点：灵敏度高、经济。 缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。,步骤： （1）制备单细胞悬液； (2)对细胞计数后接种于96孔板，一般5000个/孔（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）； （3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养； （4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，继续培养； （5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀； （6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。 注意：设好对照,CCK-8法,2.集落形成法： 注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。,3.台盼蓝排斥试验 特点：悬浮细胞较方便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。,二 微生物学筛选方法 (抗肿瘤抗生素),1.噬菌体法 2.细菌变种法 3.抗代谢法,1.噬菌体法 噬菌体：是一类能感染微生物的病毒,（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体的现象。 （2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一种噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。但是当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。,2.细菌变种法 (1)人工培育变种 如:使细菌模仿肿瘤细胞的某些代谢特点 使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感 (2)检测突变作用 如:依赖链霉素的菌株,3.抗代谢法,抗代谢物在无机氮源的合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源的营养培养基中无抗菌作用（因为有机氮源可将具有抗菌作用的物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用的物质，作为抗代谢的初筛方法。,三 精原细胞法 (抗生素和植物药) 1.建立依据 B型精原细胞具有高度敏感性 2.实验方法及判定 2228g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不同浓度，每一浓度用23只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精伊红染色，显微镜观察。,四 利用分子靶点筛选 1.抑制血管生成的筛选模型 体外：血管内皮细胞培养 体内：动物眼角膜囊 地鼠颊囊 裸鼠外耳皮下 鸡胚绒毛尿囊膜,鸡胚绒毛尿囊膜模型,鸡胚的生物学构造,对照组,低浓度药物实验组,中浓度药物实验组,高浓度药物实验组,操作步骤： （1）于实验前72h孵育受精蛋 （2）实验进行前以照蛋箱透照孵育的种蛋，凡已正常发育的种蛋可照见胚胎的影子，用铅笔做记号，弃取未发育种蛋 （3）用碘酒、酒精消毒蛋壳。敲碎蛋壳把鸡胚移入平皿中，加入EagleFs培养液5-10ml，然后，可选择在鸡胚尿囊膜血管网的任何位置放置小块明胶海绵作为筛选抗血管生成药物的载体，然后加入不同浓度的血管生成抑制剂。 （4）于加药后24h、48h和72h分别在显微镜下观察药物作用结果，并照相。 （5）血管计数。可结合自动图像分析系统、摄像等技术完成 血管生成抑制率（对照组血管面积药物组血管面积）/对照组血管面积100,2.以端粒酶为靶点的药物筛选 端粒：真核细胞染色体末端的特殊结构。维持染色体稳定性。 “生命的时钟” “有丝分裂的计数器” 端粒酶功能：通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒的长度。 端粒酶活性测定方法 端粒酶抑制剂,3.细胞凋亡通路靶点,细胞周期调控靶点 与侵袭相关的靶点 耐药相关的分子靶点 靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、个性化,五 动物模型 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要方法 整体动物在肿瘤药理学研究中的作用： 1.研究新开发药物对肿瘤的防治作用； 2.抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤机理探索； 3.探索药物和目前常规肿瘤治疗方法的 综合应用以提高疗效。,常用宿主动物： 裸小鼠 （“活的试管”） 特点：先天无毛，无胸腺，T淋巴细胞功能 完全缺失，对异种移植不产生排斥反应。 缺点：费用高，饲养条件高，不宜大量繁殖。 一般不用于初筛。 应用：观察药物对癌细胞逆转作用， 抑制增殖及诱导凋亡作用。,C57BL/6小鼠 特点：黑毛，体型小，性情温顺， 易饲养，药敏性好，为研究 Lewis肺癌首选。 应用：药物体内初筛。,模型建立方法,实体瘤建立 1.小块瘤体接种法 2.肿瘤细胞悬液接种法 3.培养细胞移植法 治疗方案：接种后生长至可触及即可治疗，依药物特性及研究目的确定方案，可给药一次，或连续几次，或一周几次连续几周。 疗效评价： 肿瘤抑制率（对照组瘤重给药组瘤重）/对照组瘤重100,腹水瘤建立及评价： 评价：对照组通常2-3周内死亡，治疗组一般观察50d左右，计算生命延长率。 生命延长率（治疗组平均存活天数对照组平均存活天数）/对照组平均存活天数100 注意事项： 1.取材时取实质部位，不要取坏死、液化部位，防止污染。 2.试验前先饲养裸鼠一周，以适应新环境，若死亡超过10%不可用，一般18-22g，4-6周龄。 3.饲养环境及鼠笼、垫料、饲料严格消毒 4.保持恒温，一般251，湿度40-60%，每天10h光照、14h黑暗。,六 基因芯片技术,1.原理 是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术，它利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品进行杂交，在一步实验中获取大量的信息。,2.基本技术路线,基因的选择与实验设计 根据表达谱数据库选择5000-10000个与发育及疾病相关的基因，制备药物筛选芯片。 芯片的制备,细胞的培养与药物刺激 根据目的药物及表达谱芯片数据库中细胞表达谱选择适当的细胞系，用适当计量的药物加入细胞培养液中，不同的时间取样，抽提刺激前后的mRNA。 大白鼠饲养与药物刺激 用常规方法饲养大白鼠