基因工程的基本操作程序--精品.pptVIP

基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤：,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因的结构（补充知识）,与RNA聚合酶结合位点,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。,2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,(原核细胞),(真核细胞),编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,基因的结构（补充知识）,与RNA聚合酶结合位点,1、编码区,2、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,一、目的基因的获取,1、目的基因的来源,2、获取目的基因的常用方法,从自然界已有的物种分离 人工方法合成,从基因文库中直接获取 如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA -基因组DNA文库（总） mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,基因文库的分类,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库,是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,2.基因文库的构建方法,直接分离法,(鸟枪法),多用于原核生物,人工合成法（真核生物）,逆转录法,化学合成法, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,（二）利用PCR扩增目的基因,1、过程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,1、过程,（二）利用PCR扩增目的基因,（二）利用PCR扩增目的基因,2、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种脱氧核苷酸、,引物,TaqDNA聚合酶,使目的基因的片段在短时间内成倍地扩增,4、结果,耐高温,3、方式：以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,2n,适宜的温度和PH值,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因等,1、基因表达载体的组成,基因表达载体的构建 核心,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,2、构建过程,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意:,将目的基因导入受体细胞（转化方法） 1、导入植物细胞,农杆菌转化法(感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力),基因枪法（单子叶植物） 花粉管通道法,显微注射法：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受 精卵中,2、导入动物细胞,3、导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,方法：,目的基因的检测与鉴定 1、分子水平的检测：分子杂交技术,检测是否插入目的基因,检测是否转录出mRNA,检测目的基因是否翻译 成蛋白质,2、个体水平的鉴定,DNA分子杂交技术,提取蛋白质，用相应的抗体进行 抗原抗体杂交，看是否有杂交带,依据其性状进行检测如：抗虫或抗病的接种实验,提取mRNA ，用标记的基因探针 与mRNA 杂交，看是否有杂交带,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR技术 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译、个体水平的检测,1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作