《植物细胞培养》PPT课件.ppt

第六章 植物细胞培养 Plant Cell Culture,第一节 植物细胞培养简介,一、概念：在培养基中培养彼此分离的细胞。 二、类型： 固体培养（solid culture）：在固体培养基中培养细胞。也称静止培养。 固体培养的特点: 1）可以跟踪单细胞生长与分裂的过程； 2）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和生理特性具有一致性； 3）细胞生长速度较慢； 4）不能长期、连续、大规模培养细胞。,2. 液体培养（liquid culture）：在运动的液体培养基中培养细胞。又称悬浮培养（ suspension cell culture）。 有2种形式： 成批培养(batch culture)：一个容器的细胞培养结束后，细胞被分散到新的容器中继续培养。 连续培养(continuous culture)：在一个容器（或者系统）中连续不断的培养植物细胞。,成批培养,连续培养,悬浮培养的特点,1）不能跟踪单细胞的分裂和生长过程； 2）细胞生长速度较快； 3）可以长期、连续、大规模培养细胞。,第二节 细胞培养的应用,进行细胞生物学研究：通过适当的培养技术，人们可以连续观察一个细胞的生长、分化和分裂的全过程，为人们研究细胞的生长、分化以及影响细胞生长、分化的条件提供了良好的实验体系。,植物细胞全能性的证明,2. 筛选变异体：在生产中，人们总是希望获得具有某些抗性的品种，如抗病、抗虫、抗盐碱、抗铝、抗除草剂等。通常的方法是在大量的植株中进行选择。这种方法不仅工作量大，而且效率低。细胞培养技术为突变体的筛选提供了快速有效的方法。在一个培养皿中，一次可以筛选20万个细胞。 将具有抗性的细胞挑选出来以后，进行培养、再生，即可获得抗性植株。,3. 生产有用化合物：利用大规模细胞培养技术可以在室内生产一些植物细胞合成的有用物质，如色素、香料、药物成分等。,第三节 细胞培养的建立、维持和生长特点,一、细胞培养的建立和维持 细胞培养通常是将植物材料接种在液体培养基中，经过摇荡建立起来的。 建立起来的悬浮细胞必须适时继代培养（subculture-将芽、愈伤组织、细胞等分成若干份，接种到新鲜的培养基中以扩大群体的过程）。通过继代，细胞就可以长期保持、繁殖，并且扩大细胞的群体。,外植体,匀桨,过滤,培养,液体培养,振荡,培养上清液,愈伤组织,液体培养,继代培养,振荡,愈伤组织(callus)是一群无明显组织分化、分裂能力强的细胞。它是植物受到创伤后或在植物激素的诱导下形成的。,分化(differentiation)形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程，如分生组织细胞转变成薄壁组织、维管组织、厚壁组织等。 脱分化(dedifferentiation)已分化、成熟的细胞（一般不再分裂）重新恢复分裂能力的过程。外植体形成愈伤组织的过程就是脱分化的过程。 再分化 (redifferentiation)愈伤组织形成其它组织或器官的过程,二、悬浮细胞的生长过程,1. 悬浮细胞生长的特点 细胞培养周期：两次继代培养所间隔的时间。 在一个细胞培养周期中，细胞的生长情况经历了慢快慢的过程（下图）。,延滞期,快速生长期,静止期,下降期,渐降期,生长量： 重量 细胞浓数量,延滞期：细胞继代培养开始后的一段增长缓慢的时间。 快速生长期(对数生长期)：细胞数量、重量或体积直线上升的时期。 渐降期：细胞生长速度逐渐减慢的时期。 静止期：新生的细胞数量与死亡的细胞数量达到动态平衡的时期。 下降期：活细胞数量不可逆下降的时期。,云南红豆杉细胞生长和蔗糖消耗动态,蔗糖浓度,细胞干重,营养耗尽,与固体培养不同, 悬浮培养要求细胞达到一定的接种细胞密度 (cells/ml)， 一般为0.5-2.5105。密度高，细胞分裂快，延滞期短；密度低则相反，如果密度太低，则细胞不分裂，最后全部死亡。故悬浮培养时有一个最低起始细胞密度（minimum initial cell density）。 最低起始细胞密度=细胞能够生长、分裂的最低接种密度。,影响最低起始细胞密度的因素,(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其最低起始细胞密度比较低；相反，则高。 (2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则起始细胞密度可以比较低。 (3) 培养基： -基本培养基 -丰富有机营养：较多种类的氨基酸和维生素等） -合适的植物激素,-条件化培养基(conditioned medium) 条件化培养基=培养过几天高密度细胞后的无细胞培养基。使用条件化培养基可以显著降低起始细胞密度。 (4) 培养方式：采用看护培养（nurse culture）是降低最低起始细胞密度的有效方法之一。 看护培养（nurse culture）=将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。,Nurse Culture,（微孔滤膜）,细胞看护培养,第三四节 单细胞培养技术,单细胞培养是培养彼此分离的单个细胞。 单细胞的培养难度较大，是研究和观察细胞生长与分裂过程的有效方法。 常用方法：微室培养和平板培养。,一、微室培养(Culture in microchamber),微室培养是在悬滴培养的基础上发展而来的。1955年DeRopp把含有细胞的液体培养基滴在玻璃板上以观测单细胞的生长。但他没有发现单细胞分裂，发生分裂的是含有几个细胞的小细胞团。 1957年，Torrey改进了培养方法，采用微室培养。利用此培养技术培养豌豆根尖单细胞，得到了含几个细胞的细胞团。1960年，Jones用条件化培养基在微室中进行悬滴培养烟草杂种细胞，得到了含30个细胞的细胞团，并用录象记录了细胞分裂的全过程。,微室,载波片,石蜡,单细胞,微室培养,观察细胞生长、分裂,二、平板培养（Plate culture）,此技术是1960年Bergamann首创，是在固体培养基中培养众多单细胞的一种方法。,1. 细胞悬浮液的制备： 旺盛分裂期的悬浮细胞过滤 滤液离心 吸去部分上清液调节细胞密度（大于最终接种密度: 51035105cell/ml）,2. 培养基的制备 配制培养基，但浓度为稀释的倍数，高温灭菌后冷至35备用。 条件化培养基的配制：悬浮细胞的培养液离心取上清液与高温灭菌的培养基等量混合冷至35备用。,3. 平板培养的制作： 将单细胞悬浮液按比例与35的固体培养基充分混合均匀后，倒入无菌培养皿中，培养基的厚度为5mm左右。盖上盖子，摇动、布匀，用Parafilme膜封口后，进行培养。 4. 培养条件： 温度为25，黑暗或弱光照。,平板培养的效果，可用植板率（plate efficiency）来衡量。 plate efficiency（%）=每个平板中新形成的细胞团数/每个平板中接种的细胞数100,影响植板率的因素,(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其植板率高；相反，则高。 (2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则植板率高。,（3）接种细胞密度：接种密度高，有利于细胞分裂，提高植板率。 接种密度过高，会使细胞团之间相互靠近、接触，这不仅造成计数困难，而且无法判断细胞团的归属，不利于细胞系克隆（clone）的选择。,烟草细胞接种密度和植板率之间的关系,(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式： 采用看护培养可以提高植板率。 平板培养为分离、筛选单细胞无性系提供了一个有效方法,第五节 植物细胞大规模培养 生产次生代谢物质,Production of Secondary Metabolites by Large-scale Culture of Plant Cells,一、 植物次生代谢和次生代谢产物,（一）次生代谢和次生代谢产物 初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢，如呼吸作用、光合作用、蛋白质和氨基酸代谢、核酸和核苷酸代谢、脂肪代谢、激素代谢等。初生代谢过程中形成的各种产物称为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。,次生代谢：建立在初生代谢基础之上的、对于植物正常的生长发育非必需的代谢，其代谢产物即为次生代谢产物。 次生代谢产物是小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性，因为是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。 植物体内的次生代谢产物种类繁多，已经分离、鉴定的有10万个左右，这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类。详细情况可参阅中药化学、天然产物化学等书。,鬼臼毒素（抗肿瘤）,苯丙素类,水飞蓟素 ：治疗急、慢性肝炎、肝硬化、中毒性肝损伤等）的良药。,苯丙素类,天然色素，绛红色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妆品生产,紫草,紫草根,紫草素,醌类,芦丁、槲皮素：治疗心脑血管疾病药物的主要成分。,槲皮素 R=H 芦丁 R=芸香糖,银杏黄酮、大豆黄酮等也是防治心血管疾病的重要物质。,黄酮类,生物碱,吗啡,镇痛作用,生物碱指来源于生物界的一类含氮有机化合物。,生物碱多具有显著而特殊的生物活性,主要成分：吗啡、可待因,海洛因 : 由吗啡合成 药物：镇痛 毒品：麻痹、毒害神经、破坏免役力，容易成瘾,罂粟=鸦片,主产地：金三角地区（缅甸、老挝、泰国）、阿富汗、巴基斯坦、南美,麻黄碱：止咳平喘,小檗碱：抗菌消炎,奎宁：抗疟疾,长春花,ajmalicine阿吗碱 : $2000/kg Vinblastine长春碱 : $2 million/kg Vincristine长春新碱 : $15 million/kg,阿吗碱,长春碱,长春新碱,紫杉醇,薯蓣皂甙元,皮质醇 可的松 皮质甾酮,皂素,（二）获得次生代谢物的方法,植物次生代谢产物的重要性：色素、香料、药物与保健品、食品添加剂、化工原料等。全球2/3的药物直接或者间接来源于植物次生代谢产物。,1. 从植物中提取：可靠，但受到资源的限制，会破坏野生资源；人工栽培则占用土地、受病虫害、自然灾害等因素的限制。 2. 化学合成：产量高、成本低，但污染环境，而且有些物质结构复杂，难以人工合成，如海南粗榧内酯；有些虽然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。,尚未合成,成本太高合成,3. 植物细胞大规模培养：植物细胞不仅具有形态全能性，而且也有化学全能性（在离体条件下可以合成整株植物能合成的物质）。 优点：不破坏、不依赖野生资源；不受环境因素的影响；环境污染小；不占用土地资源；产量可以调控等。是一种很有前途的方法。,1956年Routin和Nickell：首次提出植物细胞培养技术生产天然产物的专利以来，在这方面做了很多研究，取得了不少进展。主要成就： 证明植物细胞在离体条件下可以合成次生代谢物质； 发现了提高细胞次生代谢物质含量的方法； 可以对植物细胞进行大规模培养（=75吨）； 成功商业生产了少数次生代谢物质。,75000L Bioreactor,药用植物细胞工程普遍存在的问题： 产量不高、不稳,课堂作业（2012.10.16）： 请解释植物细胞培养中的延滞期、最低起始细胞密度、看护培养和条件化培养基能促进低密度细胞分裂等现象。 如果要用植物细胞培养生产某种药用植物的有效成分，你认为应该研究哪些技术环节？,二、 植物细胞大规模培养生产次生代谢物质研究的过程,1.选择外植体、诱导愈伤组织； 2. 通过含量分析、选择高产细胞系； 3. 研究培养条件(达到高产、稳产）； 4. 建立悬浮细胞培养、优化培养条件(达到高产、稳产）；(参考3) 5. 小试；优化培养条件(参考4) 6. 中试;优化培养条件(参考5) 7. 大规模培养(参考6) 8. 工业化生产；产品分离、纯化。,适宜的外植体,细胞系,高产细胞系,诱导,选择,高产、稳产细胞系,优化条件,放大培养/大发酵罐,高产稳产,优化条件,悬浮培养/三角瓶,高产稳产,优化条件,放大培养/小发酵罐,放大培养/中试,参考,参考,优化条件,参考,高产稳产,产品提取分离,植物细胞工程流程图：,建立,建立,建立,建立,高产稳产,工业化生产,优化条件,三、 提高次生代谢物产量的方法,尽管植物细胞培养生产次生代谢物的研究进行了50年，但真正用于生产的毕竟是少数（如紫草素、人参皂甙）。其重要原因是目标化合物的产量低、不稳定、成本高。因此，寻找提高次生代谢物产量的方法对于用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物极为重要。提高次生代谢物产量的主要途径有：,1. 选择高产细胞系,细胞系合成次生代谢物能力对用植物细胞大规模培养工业化生产次生代谢物有决定性的影响。 （1）不同植物、不同单株、不同外植体： 一种次生代谢物常在多种植物中有，但含量不同； 在同一种植物中，不同植株之间会不同； 同一株植物上，不同部位由于生理差异，往往也有不同的次生代谢物合成能力。,紫杉醇：抗癌药物,化学名：Paclitaxel ；商品名：Taxol,红豆杉（Taxus）,紫杉醇的发现,50年代末-60年代初：美国发现癌症病人大量增加 60年代中期：美国食品与药物管理局（FDA）制定计划，广泛筛选治疗癌症的药物（动物、植物、微生物） 1969年: 美国农业部（USDA）采样员在Oregon洲采取到太平洋紫杉树皮，后经过筛选试验发现有强烈的抑制肿瘤的作用,1971年：美国北卡州的三角化学研究所的化学家成功地分离出活性物质，起名Paclitaxel(紫杉醇)，并发布了它的化学结构。没有申请专利保护 1970S: 紫杉醇有很好的治疗卵巢癌、乳腺癌的作用，但临床实验导致1人死亡，FDA否决了紫杉醇 1979年：爱因斯坦医学院博士后Susan在Science上发表了紫杉醇抗肿瘤机理，重新激起人们对紫杉醇的兴趣。 1980S：广泛研究紫杉醇抗肿瘤作用，发现对多种癌症有效，特别是对耐药性卵巢癌、乳腺癌（有效率45%），且毒副作用远远小于当时发现的其它抗癌物质；发现了导致病人死亡的原因，并解决了问题。 1992年： FDA正式被批准紫杉醇临床用药。,红豆杉种类：全世界11种（北半球）。我国4种一变种：东北红豆杉、 （中国）红豆杉、云南红豆杉、喜马拉雅红豆杉（西藏红豆杉）、南方红豆杉（中国红豆杉的变种） 紫杉醇含量：干树皮中0.01%（万分之一） 数量：稀少，散生、不成林 生长：极为缓慢，50-70年成树,紫杉醇：资源稀缺,纯品：6000元/g；进口针剂：2980元/支(30mg) 1997年（1998年）国产紫杉醇针剂-泰素，出厂价1600元/支(30mg)，进口1980元/支,1999年，我国红豆杉被列为一级保护植物 1992-2001年，云南红豆杉遭到毁灭性破坏 农民卖树皮1元/公斤；商贩5元/公斤卖给丽江汉德公司，丽江汉德公司生产半成品（氯仿提取物）， 1900元/公斤供应给云南汉德。云南汉德生产紫杉醇，高于18万美元/公斤卖给美国公司。零卖价还要更高。 100公斤树皮能生产1公斤半成品；100公斤半成品可生产1公斤紫杉醇。,云南汉德生物技术有限公司非法提取、出口紫杉醇,出动武警追捕。因破坏红豆杉，先后有50多人被捕，32人被判有期徒刑。公司负责人被重判重罚,据统计：分布在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉，绝大部分在1992-2001年被剥皮死去。,汉德公司吴军、李松、齐膺等从一九九九年九月十日至二00一十一月，采用以欺骗方式骗取出口批文实施出口和更换品名报关实施出口两种方式，共走私紫杉醇成品67.9755公斤，共计人民币96351526.05元。2002年10月22日检察机关以非法经营罪和偷税罪提起公诉。判决：云南汉德生物技术有限公司犯非法经营罪和走私珍稀植物制品罪，判处罚金人民币2000万元；被告人吴军判处有期徒刑18年，并处罚金200万元；被告人李松有期徒刑九年，并处罚金10万元；被告人齐膺有期徒刑七年，并处罚金8万元；被告人明强忠犯非法经营罪，判处有期徒刑三年，缓刑四年，并处罚金5万元。同时，对被冻结和扣押的款项及存放在汉德公司的紫杉醇13.1千克予以追缴、没收，上交国库4000多万 。,种植红豆杉是目前生产紫杉醇最可靠的方法 曼地亚红豆杉,云南红豆杉,东北红豆杉,中国红豆杉,南方红豆杉,杂种红豆杉,（2）通过细胞系进行系统选择： 细胞系在培养工程中，细胞系会出现变异，通过持续选择，有可能不断提高细胞系的生产能力。大量的试验证实了这一点。,云南红豆杉细胞系,黄白色细胞,深褐色细胞,云南红豆杉细胞系统选择的结果,含量与愈伤组织的颜色、质地、生长速度有关系,紫草细胞培养,Sinenxan A：R=Ac Sinenxan B：R=CH3CH2CO Sinenxan C：R=CH3CH2CH(CH3)CO,紫杉烷Baccatin III的结构 （紫杉醇的母核）,紫杉烷Sinenxan的结构,紫杉醇Taxol,（3）细胞诱变选择细胞系：用射线（ X射线、射线、紫外线）或者化学诱变剂（如甲基磺酸乙酯EMS、硫酸二乙酯DES等）处理细胞，然后进行筛选。如Deus用X射线处理长春花细胞，获得了蛇根碱含量达2%的细胞系；Berlin等用化学诱变烟草细胞，获得了生产肉桂酰腐胺能力提高了10倍的细胞系。 （4）细胞系遗传改良：利用基因工程技术超量表达限速酶基因、阻断分支代谢的基因表达，可以提高细胞系合成次生代谢产物能力。,紫杉二烯,单萜化合物C10,倍半萜化合物C15,其它二萜化合物,异戊二烯，5C,牻牛儿醇牻牛儿醇焦磷酸C20,乙酰辅酶A,牻牛儿醇焦磷酸，10C,法呢儿醇焦磷酸，15C,紫杉二烯环化酶,Science 330, 70 (2010);,植物甾醇、皂素和三萜类物质的生物合成,2. 优化培养基 （次生代谢物的产量=细胞生长量细胞合成代谢物的能力）,（1）基本培养基：不同的基本培养基对细胞生长和次生代谢物的合成影响很大。基本培养基中N和P的浓度高往往有利于生长，但不利于次生代谢物的合成。 （2）植物激素：植物激素对次生代谢物生产的影响非常复杂，需要分别试验、优化。一般2,4-D促进细胞生长，但抑制代谢物的合成。如在有2,4-D存在时，长春花、蔓陀萝、天仙子、罂粟等细胞不能合成生物碱，鸡眼藤不能合成蒽醌。紫草细胞培养时，IAA能促进紫草素的合成，而NAA，2,4-D则抑制其形成。但高浓度的2,4-D却能促进烟草中泛醌-10的合成。,蔗糖浓度的影响:,维生素的影响,NO3-：NH4+的影响,3. 饲喂前体物质（precursor）,在细胞内次生代谢物质是以初生代谢物质为原料，经过一系列的化学转化而合成的，因此，每种次生代谢产物都有一条生物合成途径。向培养基中添加生物合成途径的中间体物质（前体物质）是提高次生代谢物产量的一个有效方法。如紫杉醇（Taxol）：,紫杉醇结构可以分为母核（baccatin III）和侧链2部分,侧链则是由苯丙氨酸与苯甲酸形成的；Baccatin III是二萜类化合物，而二萜类化合物的生物合成途径已经基本明确。,紫杉二烯,单萜化合物C10,倍半萜化合物C15,其它二萜化合物,异戊二烯，5C,牻牛儿醇牻牛儿醇焦磷酸C20,乙酰辅酶A,牻牛儿醇焦磷酸，10C,法呢儿醇焦磷酸，15C,试验证明，向培养基中添加紫杉醇合成的前提物质（牦牛儿醇、牦牛儿醇基牦牛儿醇、苯甲酸、苯丙氨酸等）可以使红豆杉细胞中紫杉醇含量提高1-5倍；,向鬼臼细胞培养基中添加前提物质使鬼臼毒素含量提高12倍。 在添加前体物质之前，必须了解该次生代谢物的生物合成途径。,4. 使用诱导子（elicitor）,诱导子=指能刺激细胞合成次生代谢产物的物质。 诱导子分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指微生物，特别是致病微生物（活菌、高温灭菌后的菌物或其匀浆物）、纤维素酶、果胶酶、微生物多糖等；非生物诱导子是指重金属离子（Ag+, V2+, Hg2+, Cu2+）或Ca2+等。 诱导子在细胞培养的中后期（接近细胞最大生长期）加入。,5. 改善培养条件,培养条件对细胞生长和合成次生代谢物质的影响因植物种类而异，无统一的规律，最佳培养条件需要通过试验才能确定。如光照可以刺激长春花细胞合成蛇根碱、银杏细胞合成黄酮，却抑制黄连细胞中小檗碱、红豆杉细胞中紫杉醇的合成。温度对细胞生长和次生代谢物合成的影响往往是不一致的，如长春花和骆驼蓬细胞的最佳生长温度分别是27和30，但合成生物碱的最佳温度是分别是16和25，而胡萝卜在25和28时细胞合成花色素的能力无差异。 除了温度、光照外，培养基的酸碱环境也影响到次生代谢物的合成。如雷公藤细胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0时最强；番薯细胞合成色醇的能力在pH6.3时最大，在pH4.8时则不能合成；胡萝卜细胞合成花色素的能力在pH4.5时最强，提高pH值则导致合成能力下降。,6. 改进培养方法,（1） 两步培养法：细胞生长与次生代谢物合成所需要的条件往往是不同的，并且不同步。对于生长和次生代谢物质合成不同步的植物细胞（如次生代谢物质在细胞生长后期积累），可以在前期采用促进细胞生长的培养基和培养条件，在后期采用促进次生代谢物合成的培养基和培养条件，从而兼顾细胞的生长量和次生代谢物的合成，达到提次生代谢物产量的目的。,云南红豆杉细胞生长与紫杉醇含量动态,紫杉醇含量,生长量,（2）两相培养法：根据化学反应平衡原理知道，产物的积累会抑制化学反应正方向的速度（反馈调节），移去产物则可以促进化学反应朝正方向进行；同时，产物的积累还会对细胞生长有毒害。因此，如果能将次生代谢物收集起来，就可以促进代谢物的合成。两相培养可以解决这个问题。,两相培养法有2种方式。 液固培养: 液相是细胞和液体培养基，固相是能吸收次生代谢物的物质，如树脂、活性炭等。 液-液培养:一层液相是细胞和液体培养基，另一层液相是能溶解次生代谢物的有机溶剂（如乙酸乙酯）。 这2种方法都可以减少培养基中次生代谢物浓度，防止负反馈调节，从而提高代谢物的产量。特别是在培养基中加入促进细胞内次生代谢物向培养基中分泌的物质（如DMSO）时，效果更好。 香竺葵细胞两相培养（液-液培养）：倍半萜的产量提高了500倍。,7. 固定化细胞培养 （immobilized cell culture） 固定化细胞培养是先将细胞固定在一些惰性基质（如海藻酸钙、聚酰胺、琼脂糖、有机高分子泡沫、玻璃等）表面，并将其做成小块或珠状，再放入液体培养基中培养，或放入柱形培养容器中，让培养基循环通过柱形培养容器。,在普通的悬浮细胞培养时，细胞的生长周期比较短，一般每隔15-35天就必须继代。而在固定化细胞培养时，细胞的培养周期可以达到90-180天以上，因而大大减少了细胞继代培养的次数。 对于一些能将绝大部分次生代谢产物分泌到培养基中的植物细胞，用固定化细胞培养方法进行次生代谢物生产是非常有意义的，这不仅可以减少对细胞的操作，有利于培养条件的优化，提高产量，而且也简化了产物的分离过程，从而可以降低生产成本。,辣椒细胞：辣椒素提高了5倍 野葛细胞：异黄酮提高了17.3倍 黄连细胞：小檗碱提高了11倍 香竺葵细胞：单萜增加了20倍,固定化培养,第四节 毛状根培养与次生代谢物生产,毛状根（hariy root, 发根）是植物的器官、组织或细胞在发根农杆菌诱导下产生的细小、多分枝的不定根。,青蒿的毛状根,烟草的毛状根,毛状根特点：生长快，不依赖激素。 毛状根具有组织结构，所以它对于生产一些需要细胞出现组织化才能大量合成的次生代谢产物特别有意义，是生产次生代谢产物的一个很有潜力的方法。,毛状根,再生根,悬浮细胞,长春花,总生物碱,阿玛碱,1986年：Mano Y.等建立的29个日本莨菪毛状根无性系均能生产阿托品烷生物碱，从中选育出的克隆，其生长速度比正常植株高102倍，莨菪碱含量达1.3 %，为原植株根中含量的3倍。 1987年：Yochikawa等人通过诱导人参毛状根，其生长速度为用外源激素诱导根的2倍，人参皂甙含量达干重的0.95%，为天然根的2倍(0.4% )以上。 1990年：Furuga等用20吨的发酵罐进行人参毛状根的培养，每月产量为4吨的新鲜产物。,1993年：孙敏等诱导出萝芙木的毛状根，从296个无性系中筛选到4个生长快、分支多的萝芙木转化根系，其中一个的利血平含量是干重的0.124%，为原植株的3倍。 1996年：芮和恺等诱导的黄芪毛状根16 d内可增殖404倍。 1997年：郑志仁等用发酵罐大量培养黄芪毛状根，3星期后，毛状根生长量分别达到35倍。 1997年：黄遵锡从短叶红豆杉诱导出毛状根，选育出的5株无性系20d 后生物量增加9倍，紫杉醇含量是愈伤组织的1.3- 8.0倍。,毛状根的诱导,发根农杆菌，革兰氏阴性土壤杆菌，自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤或者毛状根。,毛状根诱导机理：,发根农杆菌中Ri质粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，含有rolA, roB, rolC, rolD genes)转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞毛状根。,毛状根诱导过程：,1. 外植体选择和表面消毒； 2.发根农杆菌的活化与培养 保存的农杆菌在YEP培养基上化平板； 单菌落接种在液体YEP培养基中，28/200rpm, 2 days； 1:30-50放大培养,28/200rpm,6-7h (OD600=0.5-0.8)； 离心收集菌液，悬浮在MS0培养基中。 3. 感染（5-30min) 4. 共培养（在无激素、有乙酰丁香酮的培养基上培养2-5天） 5.毛状根形成（在无激素、有抗生素培养基）,毛状根的形成,毛状根诱导是发根农杆菌介导的植物转基因，诱导效率受到很多因素的影响,长春花毛状根的诱导,形态不一的毛状根,毛状根选择和培养条件优化,生长速度不同,Ajmalicine (a) and serpentine (b) production on the basis of mg/g dry weight of different hairy root clones of C. roseus var. Prabal,代谢产物合成能力不同,蛇根碱,阿玛碱,第五节 生物转化(Biot