《浅谈基质效应》PPT课件.ppt

浅谈基质效应,基质效应产生的原因和影响 基质效应的确认方法 基质效应的消除,浅谈基质效应,基质效应的产生原因,基质效应的产生原因,所谓基质，指标本中除分析物以外的一切组成。以测定血中红霉素的浓度为例，除了红霉素之外的蛋白、磷脂及其他内源性物质皆为基质。 基质效应，按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件的定义为 标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响； 基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如红霉素测定中磷脂、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响。,基质效应的产生原因,主要针对使用液相色谱-质谱联用技术分析生物样品中的化合物所产生的基质效应进行讨论。 而在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应。,根本原因是什么？ 基质效应会产生哪些不好的影响,基质效应的产生原因,标准曲线法 柱后灌注法 监控法,基质效应的确认方法,样品配制方法：配制三种不同的标准曲线（每条标准曲线7个点，每一种配制方法五样本） 1、药物+内标：用流动相稀释到一定浓度 2、药物+内标：用含有5种不同来源的空白生物样品的流动相 稀释 3、正常配制的生物样品,标准曲线法,评价方法： 通过比较3组标准曲线待测组分的绝对响应值、待测组分与内标的响应值比值和标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。,标准曲线法,绝对响应值比较 第1组测定结果可评价色谱系统和检测器的性能以及整个系统的重现性。 第2组测定结果同第1组测定结果相比，若待测组分响应值的相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应的影响。 第3组测定结果，若待测组分响应值的相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应和提取回收率因血浆来源不同而不同的共同影响。,标准曲线法,绝对响应值比较 如果将第1组、第2组和第3组测得的相应的响应值分别用A、B、C表示，可按下列公式分别计算基质效应(ME)，提取回收率(RE)和方法效率(PE)： ME( )=BA100 (1) RE()=CB100 (2) PE()=CA100=(MERE)100 (3) 公式(1)计算得到的ME为绝对基质效应。相对基质效应通过对不同来源样品间的B值进行比较获得。当ME值等于或接近100时，表明不存在基质效应的影响；当ME值大于100时，表明存在离子增强作用；当ME值小于100时，表明存在离子抑制作用。,标准曲线法,待测组分与内标的响应值比值和标准曲线的斜率 Standard line slopes as a measure of a relative matrix effecting quantitative HPLCMS bioanalysis The results of these studies indicated that the variability of standard line slopes in different lots of a bio fluid precision of standard line slopes expressed as coefficient of variation, CV (%) may serve as a good indicator of a relative matrix effect and, it is suggested, this precision value should not exceed 34% for the method to be considered reliable and free from the relative matrix effect liability.,标准曲线法,另外，有学者建议使用低、中、高三浓度的质量控制样品（QC）来评价基质效应的大小；有人建议使用定量下限（LLOQ）水平的6个个体的基质来评价。,标准曲线法,将空白生物样品的提取液和空白溶剂分别进样进行液质分析，同时利用注射泵将含相同浓度待测物的标准溶液通过色谱柱与质谱接口之间的三通注入到色谱柱流出液中。如果同空白溶剂的萃取离子图谱相比，空白提取液的萃取离子图谱的响应信号明显减弱或增强，则表明存在基质效应的影响。,柱后灌注法 (Post-column infusion method),柱后灌注法,样品配制：分别用液液萃取（正己烷-异丙醇）、固相萃取、沉淀蛋白（乙腈沉淀和高氯酸沉淀） 1、正常配制空白样品 2、用水代替血浆配制样品 3、流动相,柱后灌注法,液液萃取,ESI,固相萃取,乙腈沉淀,高氯酸沉淀,液液萃取,固相萃取,乙腈沉淀,高氯酸沉淀,APCI,由于基质效应是无法监测的，所以消除困难。如果能够用一种物质代表基质效应，那么我们就能够直观的看到基质的具体保留行为，从而分离基质与待测物，消除基质效应。,监控法,Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analyses Erin Chambers , Diane M. Wagrowski-Diehl, Ziling Lu, Jeffrey R. Mazzeo,监控法,In our studies, we evaluate several sample preparation methods, including protein precipitation (PPT), liquidliquid extraction (LLE), silica-based solid-phase extraction (SPE) and polymeric SPE. Because endogenou phospholipids have been identified as a major source of matrix effects by multiple researchers, we monitor the levels of the various phospholipids in the samples to compare relative cleanliness of final plasma extracts.,监控法,监控法,选择合适的样品制备方法 优化色谱条件 质谱条件的选择 内标物的选择,基质效应消除,选择合适的样品制备方法 总体来讲，基质效应是与生物样品处理不干净密切相关的。我们可以通过稀释处理后的溶液或者降低进样量，来降低基质效应对测定的影响，但这是治标不治本，背景噪音在降低的同时，待测物的响应也降低，对改善我们的测定灵敏度没有太大好处。其实，更为关键的是选择合适样品前处理方法。,基质效应消除,基质效应消除,我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE）。PPT适应于绝大多数化合物，对蛋白结合率的高低没有要求，操作步骤相对简捷，缺点就是处理后的样品不是很干净，内源性物质较多，从而产生较强的基质效应；LLE适于极性相对小、蛋白结合率低的化合物，提取步骤相对繁琐，但处理后的样品尤为洁净；而SPE根据填料的不同，适于分析的化合物的种类也有所差别，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板，该方法特点是样品处理后干净，操作装置简单，绝大数的内源性物质被去除，使待测物浓缩，提高检测的灵敏度。,优化色谱条件 基质效应的产生，是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱，从而产生竞争抑制引起的。优化色谱条件，改变内源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而进入质谱的时间不同，这样就可以去除或降低基质效应的影响。比如待测物易离子化，那么调节样品或溶液中的pH值，会对它的保留、选择性和灵敏度产生很大的影响。 如果有切换阀，最好把样品峰出峰前一分钟之前的都切换调 。,基质效应消除,请看下面两图，色谱条件优化前,基质效应消除,色谱条件优化后,基质效应消除,从优化后的色谱图中，可以看出在4.2min左右有部分内源性物质的小峰出现，这说明如果化合物在这时候被洗脱下来，那么内源性物质就会一同下来，同时进入离子源，从而产生基质效应。为了避免这个问题，我们优化了色谱条件，将洗脱程序变缓，使内源性物质和待测得化合物分开，这样就减小了基质效应。,基质效应消除,质谱条件的选择 众所周知，基质效应在液质检测中有所体现，但在液相-紫外检测中却没有，这跟它们检测的原理是相关的。在液质分析中，我们经常使用的是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。ESI源由于其电离原理是液相离子化，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面，从而基质效应比较明显。所以我们在实际应用中，如果遇到使用ESI源基质效应较大，可以考虑换用APCI源尝试一下，看看响应是否能够满足要求，基质效应是否有所降低。 同时，我们还可以考察一下正离子检测模式和负离子检测模式下基质效应的大小，一般情况下，负离子的背景噪音要低于正离子的。,基质效应消除,内标物的选择 在生物分析中，由于样品处理过程复杂，为了保证其操作的准确性，要使用内标来校正操作的误差。内标的选择，主要从同位素标记物和待测物的同系物里寻找。实际上，同位素标记物是最为理想的内标物，它与待测物的化学性质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们的影响也一致，这样就可以出去基质效应的影响。但是由于同位素标记物价格昂贵，而且不易获得，使这种优越性大打折扣，在不得已的条件下，还需